杜欣穎，王 笳，王建明，周 磊，鄭程莉*

(1.四川省中醫(yī)藥科學院，四川 成都 610200；2.四川養(yǎng)麝研究所，四川 成都 610200)

【研究意義】麝香是中國名貴中藥，為雄性麝類動物香囊分泌的產物，其產量受激素調控影響。FSHβ和LHβ基因在林麝泌香過程中發(fā)揮重要作用，然而它們與泌香的關聯(lián)分析鮮有報道。本文采用DNA混池測序技術對FSHβ和LHβ基因多態(tài)性位點進行檢測，并將突變位點位點與麝香產量進行關聯(lián)分析，以期從遺傳水平上揭示林麝產香性能機理?！厩叭搜芯窟M展】麝香(Moschus)是傳統(tǒng)中藥的重要成分，具有開竅醒神，活血通經，消腫止痛的功效[1]。麝香主要由我國一級重點保護瀕危野生藥用動物林麝(Moschusberezovskii)雄性個體分泌。為了保護野生林麝資源，我國從1958年開始人工養(yǎng)麝。歷經半個世紀，現(xiàn)仍處于試養(yǎng)階段，麝香產量低[2]，其根本原因在于林麝選育程度低下，傳統(tǒng)遺傳育種方法費時費力，在林麝上實施起來有較大困難。家畜中，人們運用多態(tài)性位點關聯(lián)分析[3-4]、分子標記輔助選擇[5]等技術極大地提高了一些家畜的選育進程。縱觀林麝的選育還較為原始，在家畜中研究得較為深入的多態(tài)性位點關聯(lián)分析[6-8]還鮮有報道，因此本研究以多態(tài)性位點關聯(lián)分析為實驗方法，從遺傳水平上揭示林麝產香性能機理，以期為加快林麝選育提供理論依據(jù)。FSHβ和LHβ基因是位于性腺軸上的關鍵基因，也是影響產香性能的候選基因[9]。在泌香過程中，垂體前葉堿性細胞分泌的糖蛋白激素FSH和LH作用于雄麝的性腺，通過調節(jié)雄性激素的分泌進而影響麝香的生成[10-11]。汪建隆等也證實FSHβ與LHβ影響麝香分泌[12]。然而在林麝群體中，F(xiàn)SHβ和LHβ基因及其上下游到底有多少個多態(tài)性位點還不得而知?！颈狙芯壳腥朦c】研究利用Hiseq混池測序方法在林麝全基因組范圍內進行多態(tài)位點篩選，重點關注FSHβ、LHβ基因及其上下游2 k區(qū)域，再結合所研究的林麝個體的產香數(shù)據(jù)做關聯(lián)性分析，獲得的顯著性多態(tài)位點可運用于后續(xù)的分子標記輔助選擇。【擬解決的關鍵問題】本研究對于了解林麝種群的遺傳特性有重大意義，也對于提高麝香的產量具有實際的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取四川養(yǎng)麝研究所馬爾康養(yǎng)獐場100頭林麝為試驗材料，統(tǒng)一于2018年10月集中采香，取盡每頭林麝香囊中的麝香，現(xiàn)場稱重記錄，獲取每頭林麝的年產香數(shù)據(jù)。在取香前稱取的每頭林麝體重，對應采集每頭林麝后肢靜脈血管的2 mL血液用于提取DNA。

1.2 基因組DNA混池Hiseq測序

用天根血液DNA提取試劑盒(貨號DP304)提取血液樣本DNA，并用Nanodrop檢測樣本DNA質量和濃度。將提取的DNA樣本均勻稀釋至50 ng/μl，每個樣品取2 μl均勻混合，構建試驗林麝DNA混池構建文庫。采用Illumina平臺進行高通量測序，測序數(shù)據(jù)以ls35[13]為參考序列進行注釋比對。

1.3 試驗群體質譜分型

根據(jù)Hiseq檢測到的潛在SNP位點，本實驗采用飛行質譜檢測方法對林麝個體進行基因分型。根據(jù)FSHβ和LHβ基因的20個SNP 已知的序列信息，設計引物，引物信息如表1所示。

表1 質譜引物信息

續(xù)表1 Continued table 1

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel 2013統(tǒng)計各個位點的等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)，并進行Hardy-Weinberg檢驗。

其中：NAA、NAB、NBB分別為群體中基因型為AA、AB、BB的個數(shù)。

其中,N為等位基因個數(shù)，P和Pi為第和第i個等位基因在群體中的頻率。

其中,Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因頻率，m為等位基因數(shù)。

采用SPSS 軟件對個體基因型與麝香品質和產量數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析，設定SPSS中最小二乘法擬合線性模型和Ducan法進行多重比較?？紤]場效應，建立以下統(tǒng)計分析模型。

(1)單基因效應方差分析：Y=μ+G+p+e;

Y表示性狀測定值，μ代表群體均值，G為基因型效應，p為場效應，e為隨機殘差。

(2)組合基因型效應方差分析：Y12=μ+G1+G2+G12+p+e;

Y12表示性狀測定值，μ為群體均值，G1是第一個位點的基因型效應，G2是第二個位點基因型效應，G12是位點1和位點2的交互效應，p是場效應，e為隨機殘差。

2 結果與分析

2.1 Hiseq測序結果及SNP位點分析

利用Qubit Fluorometer對提取的林麝基因組DNA濃度和純度進行檢測，結果顯示混池樣品質量合格。結合體重與產香數(shù)據(jù)，去除提取DNA質量差的個體，在100個樣品中，有74個樣品符合實驗要求。通過Illumina Hi-Seq2000測序平臺，總共測得1014.48 G raw data，去除低質量reads和冗余數(shù)據(jù)后得到151.9 G clean data。以ls35為參考基因組[10]，整體比對率達到99.55 %，測序深度為52.49 X，覆蓋率達到94.96 %。總共得到8259 941個SNP位點，其中98.91 %的突變位于基因間區(qū)內。

2.2 FSHβ和LHβ基因內SNP位點驗證

結合參考基因組基因，本研究采用飛行質譜檢測方法對林麝74個個體進行基因分型。根據(jù)候選基因FSHβ和LHβ序列(GeneBank：JN164268，JN164267)的已知信息，選擇28個潛在SNP 位點進行質譜分析驗證，20個成功分型，具體位點信息如表2所示，質譜分型結果如圖1所示。說明基于高通量測序篩選的SNP位點大部分是可驗證的。

表2 SNP位點位置信息

2.3 試驗群體遺傳學參數(shù)

對質譜分型成功的20個SNP位點進行多態(tài)性分析，結果表明，在74個樣本中，SNP01和SNP03哈溫P值均小于0.05，基因型頻率分布顯著偏離哈代-溫伯格平衡，這些位點不作單倍型分析。其余位點均處于平衡狀態(tài)(P>0.05)，詳細結果見表 3。

表3 基因多態(tài)性分析

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

2.4 SNP與林麝產香性能的關聯(lián)分析

通過單個SNP位點與產香性狀進行關聯(lián)分析表明，位于LHβ基因的9個SNP位點中，SNP13與林麝產香量性能顯著相關(P<0.05)，TT為優(yōu)勢基因型。這些位點與體重的相關性均未達到顯著水平(P>0.05，表4)。

位于FSHβ基因的9個SNP中，有2個SNP位點SNP15、SNP20與林麝產香量顯著相關(P<0.05)，SNP15中AA為優(yōu)勢基因型，SNP20中TT為優(yōu)勢基因型。這些位點與體重的相關性也未達到顯著水平(P>0.05，表5)。

3 討 論

3.1 試驗材料的選擇

林麝為國家一級瀕危保護動物，實驗材料來源珍貴。本研究操作人員熟練了掌握林麝血液采集的方法，在盡量減少對林麝刺激的情況下，迅速采集林麝肢外周靜脈血，為試驗的開展提供了充足的研究原材料。

本研究材料來源地馬爾康養(yǎng)獐場，為全國最大的人工養(yǎng)麝馴養(yǎng)基地，現(xiàn)存林麝800余頭，有300多頭公麝可作為試驗對象，最大限度的反應了選擇的研究樣本能代表整體和種群的特征，對分析林麝個體的基因型，估測不同基因型對泌香性狀的關聯(lián)分析產生至關重要的影響。根據(jù)前期生產記錄，本研究能充分了解這些個體的遺傳特點，弄清他們之間的血緣關系，為雜種優(yōu)勢利用提供最佳配合力方面的信息，為今后更合理的開發(fā)利用這些公麝群體，提高泌香性能，選育高產群體奠定基礎。

表4 LHβ基因與產香性狀及體重的關聯(lián)分析

表5 FSHβ基因與產香性狀的關聯(lián)分析

3.2 林麝泌香候選基因的選擇

研究報道性腺軸激素與林麝的泌香有密切關系，主要通過下丘腦-垂體-性腺軸調控泌香過程，具體林麝泌香的途徑如下：丘腦下部→LRH→垂體前葉→LH、FSH→睪丸間質細胞→雄性激素→麝香腺→分泌香液→麝香內轉化→麝香。本研究選取了與泌香過程調控密切相關的2個候選基因(FSHβ、LHβ)進行泌香機制研究。林麝與其他哺乳動物的FSH和LH基因是共同起源的[9]，在泌香過程中垂體前葉堿性細胞分泌的糖蛋白激素FSH和LH作用于雄麝的性腺，通過調節(jié)雄性激素的分泌進而影響麝香的生成。汪建隆等[12]也證實FSH與LH影響麝香分泌。在分型過程中，本研究僅對上述基因的外顯子和啟動子區(qū)域進行了研究，沒有對其內含子進行研究，研究不充分，還需進一步完善。

3.3 高通量篩選SNP位點的準確性

本研究在林麝全基因組水平上一共篩選了8 259 941個SNP位點，這對于深入研究其生物機理具有重要的理論意義。對產香候選基因FSHβ和LHβ的28個SNP 進行質譜分型，其中5個SNP位點由于技術原因質譜分型失敗，3個SNP位點檢測出來均無突變，其余20個SNP位點均成功分型，除去技術原因，分型成功率達87 %，因此本研究測得的SNP具有較高準確性。

3.4 LHβ基因多態(tài)性與產香性能的關聯(lián)分析

本研究選擇了LHβ基因的11個SNP位點進行驗證，并將其多態(tài)性與林麝產香性能進行關聯(lián)性分析。其中SNP01和SNP03的哈溫P值均小于0.05，基因型頻率分布顯著偏離哈代-溫伯格平衡。我們認為原因可能是，群體中人工選育對這一基因座的選擇壓力不強，所以要提高選擇強度，進一步加強選育工作。其余9個SNP位點，通過單個SNP位點與產香性狀進行關聯(lián)分析表明，編號為SNP13的位點突變，與林麝產香量性能高度相關(P<0.05)。SNP13距離基因啟動子3648 bp，位于基因下游1758 bp處，堿基C突變?yōu)榱薚。其中TT型個體相比于CC、CT型個體產香量存在極顯著差異(P<0.01)，是優(yōu)勢基因型。林麝體重與LHβ的SNP未達到顯著相關(P>0.05)，說明LHβ基因多態(tài)性對林麝的體重影響不大。

3.5 FSHβ基因多態(tài)性與產香性能的關聯(lián)分析

在FSHβ基因上下游驗證得到9個SNP位點，通過單個SNP位點與產香性狀進行關聯(lián)分析表明，分別位于基因上游1904 bp處的SNP15和1341 bp處的 SNP20與林麝產香量性顯著相關(P<0.05)，SNP15中的AA型與GG型個體存在極顯著差異(P<0.01)，是優(yōu)勢基因型。體重與FSHβ基因相關性也均未達到顯著水平(P>0.05)，說明FSHβ基因多態(tài)性對林麝的體重影響不大。

4 結 論

本研究通過高通量測序對100只圈養(yǎng)林麝進行多態(tài)性檢測，在全基因組范圍得到了8 259 941個潛在SNP位點。利用質譜分型，對100只林麝進行質譜分型，結合體重與產香數(shù)據(jù)，去除提取DNA質量差的個體，發(fā)現(xiàn)只有74個樣品符合實驗要求。在FSHβ和LHβ基因中及上下游驗證得到20個SNP位點，其中14個SNP位于基因的非編碼區(qū)，并發(fā)現(xiàn)位于FSHβ基因上游的SNP15、SNP20和位于LHβ基因下游的SNP13與林麝泌香性能高度相關(P<0.05)。這些突變位點可作為分子標記運用于林麝的人工選育，并為高產香林麝群體培育選種提供輔助依據(jù)。