岳建華，史亞冰，李文星，董 艷，張 燕，李文楊*

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院園藝學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464100；2.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院林學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464100；3.信陽(yáng)市大別山區(qū)園藝植物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464100)

【研究意義】碳源可為植物離體培養(yǎng)提供能量，合成細(xì)胞碳骨架，參與滲透壓、氧化脅迫平衡的調(diào)節(jié)[1]。不同種類(lèi)及濃度碳源可顯著調(diào)節(jié)植物離體培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)建成，影響植物器官發(fā)生途徑(Organogenesis)或體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic embryogenesis，SE)效果[2]。不同植物、同種植物在離體培養(yǎng)不同階段所需要的碳源種類(lèi)及濃度不同[2]。蔗糖為最普遍應(yīng)用的碳源，牡丹(Paeoniasuffruticosa)組織培養(yǎng)時(shí)，蔗糖效果優(yōu)于可溶性淀粉、無(wú)水葡萄糖[3]；麥芽糖利于棉花(Gossypiumhirsutum)胚性愈傷組織誘導(dǎo)，葡萄糖利于其胚狀體的形成和植株再生[4]；3 %蔗糖利于布朗百合(Liliumbrownii)離體再生[5]；2 %葡萄糖利于山核桃(Caryacathayensis)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，而5 %的蔗糖利于其體胚萌發(fā)[6]。綜上，碳源種類(lèi)及濃度可顯著影響離體培養(yǎng)的效果[2,7]，對(duì)特定物種特定發(fā)育階段進(jìn)行精細(xì)的碳源調(diào)控可顯著提升離體培養(yǎng)的效果。【前人研究進(jìn)展】百子蓮‘Big Blue’(Agapanthuspraecoxssp.orientalis‘Big Blue’)又稱(chēng)藍(lán)百合，為藍(lán)色大花品種，花姿優(yōu)雅，具有極高的觀(guān)賞價(jià)值，且抗逆性極強(qiáng)，在國(guó)內(nèi)已逐步推廣，市場(chǎng)前景廣闊[8]。植物組織培養(yǎng)，尤其是SE技術(shù)成為百子蓮快繁的重要途徑[9]。雖然百子蓮的SE體系已經(jīng)建立[9-10]，但植物體胚發(fā)生的機(jī)制仍是未解之謎[11]，導(dǎo)致體胚發(fā)生效率較低。離體條件下，植物SE過(guò)程是一個(gè)受激素[12]、碳源[2,13]、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)及培養(yǎng)環(huán)境[14]共同調(diào)控的復(fù)雜發(fā)育過(guò)程[15]，目前百子蓮S(chǎng)E體系的研究?jī)H以PIC為激素、蔗糖作為碳源[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】碳源對(duì)植物離體培養(yǎng)具有重要影響，但對(duì)百子蓮S(chǎng)E的調(diào)節(jié)效果未見(jiàn)系統(tǒng)研究，尤其是在成熟胚發(fā)育階段的調(diào)節(jié)效果及機(jī)理鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬利用胚性愈傷(Embryogenic callus，EC)為試材，通過(guò)蔗糖、葡萄糖、麥芽糖及濃度(2 %～4 %)[13]的比較，優(yōu)化百子蓮‘Big Blue’體胚發(fā)生體系，為百子蓮S(chǎng)E快繁提供技術(shù)參考。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定糖代謝、激素代謝、氧化脅迫等生理指標(biāo)，初步揭示碳源種類(lèi)及濃度對(duì)成熟胚發(fā)育的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，豐富植物體胚發(fā)生理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

百子蓮‘Big Blue’購(gòu)自南京市彩虹花卉公司，2018年5月，選取5年生植株未開(kāi)裂的小花苞，切取小花梗作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，參照何葉[16]的方法。愈傷組織每月繼代1次，7～9個(gè)月后，得到單細(xì)胞起源的EC，繼代6個(gè)月后用于試驗(yàn)研究。選取狀態(tài)一致、顏色鮮黃、結(jié)構(gòu)疏松的EC。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照表1糖種類(lèi)及濃度進(jìn)行培養(yǎng)基配制。

1.3 培養(yǎng)基配制

稱(chēng)取MS干粉(Phytotech Lab M519)4.43 g·L-1、

表1 培養(yǎng)基中糖種類(lèi)及濃度

按2 %、3 %、4 %(w/v)濃度分別加入3種糖，用磁力攪拌器溶解混勻，1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6.0，加瓊脂粉7.0 g·L-1，121 ℃高壓滅菌25 min，降溫至60 ℃置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，分裝至90 mm× 16 mm玻璃培養(yǎng)皿，每培養(yǎng)皿分裝25 mL培養(yǎng)基，冷卻至室溫后接種。

1.4 材料接種

體胚誘導(dǎo)階段，每個(gè)培養(yǎng)皿平板接種1.0 gEC，平分為大小基本相同的7個(gè)細(xì)胞團(tuán)，每處理接種5個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3次。獲得均勻一致的幼胚用于成熟胚發(fā)育階段實(shí)驗(yàn)，接種方法同體胚誘導(dǎo)。

1.5 培養(yǎng)條件

幼胚誘導(dǎo)、成熟胚發(fā)育過(guò)程設(shè)溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度65 %，暗培養(yǎng)1周后，轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)(14 h/10 h，光/暗)，光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2·s-1。光下繼續(xù)培養(yǎng)3周后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)記錄

以誘導(dǎo)獲得的幼胚及成熟胚數(shù)量作為數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，分別統(tǒng)計(jì)幼胚(≥1 mm，乳白色)和成熟胚(≥5 mm，具有完整植株結(jié)構(gòu)，形態(tài)學(xué)上端轉(zhuǎn)為綠色)數(shù)量。

1.7 生理測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定糖類(lèi)、激素、活性氧與保護(hù)酶等生理指標(biāo)，參照Pradko(2015)的方法[17]，委托上海酶聯(lián)生物科技有限公司測(cè)定。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016、GraphPad Prism 5、Adobe Acrobat DC、Adobe Photoshop軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖，用IBM SPSS Statistics 20數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(Duncan法，P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糖種類(lèi)及濃度對(duì)百子蓮幼胚誘導(dǎo)的影響

由圖1可知，3種糖及其濃度對(duì)體胚誘導(dǎo)效果具有顯著影響，蔗糖的誘導(dǎo)效果相對(duì)較好，其次為葡萄糖、麥芽糖。其中3 %蔗糖處理成胚數(shù)量最多，平均為117.33個(gè)，顯著高于其他各處理(P< 0.05)，幼胚呈現(xiàn)松散的顆粒狀，乳白色。3種濃度葡萄糖處理，對(duì)成胚數(shù)量影響不顯著，其中3 %葡萄糖處理成胚數(shù)量較多，其次為2 %和4 %葡萄糖處理；葡萄糖處理幼胚的一致性較好，尺寸略小于蔗糖處理。以麥芽糖作為碳源的成胚數(shù)量較少，同步化效果較差。

2.2 不同糖種類(lèi)及濃度對(duì)百子蓮成熟胚發(fā)育的影響

不同種類(lèi)和濃度糖對(duì)百子蓮成熟胚發(fā)育存在顯著影響，蔗糖相對(duì)較好，其次為葡萄糖、麥芽糖(圖2)。其中2 %蔗糖處理成熟胚數(shù)量最多，為51.75個(gè)，顯著高于其他各處理(P<0.05，圖2-B)，多為鮮綠色(圖2-A)，而4 %麥芽糖處理效果最差，平均為4.00個(gè)。隨蔗糖濃度的提高，成熟胚數(shù)量逐漸減少。3種葡萄糖濃度處理對(duì)百子蓮成熟胚數(shù)量影響不顯著，其中2 %葡萄糖處理成熟胚數(shù)量相對(duì)較多。麥芽糖作為碳源的成熟胚數(shù)量最少，處理間差異不顯著，3 %效果相對(duì)較好，多為黃綠色(圖2-A)。

2.3 不同糖濃度對(duì)百子蓮成熟胚發(fā)育糖代謝的影響

碳源對(duì)百子蓮成熟胚發(fā)育期糖代謝具有顯著影響(圖3)?？偺呛繙y(cè)定結(jié)果顯示，葡萄糖和麥芽糖處理整體上高于蔗糖處理，隨著蔗糖濃度的升高總糖含量逐漸降低，與成熟胚數(shù)量的變化規(guī)律基本一致。而葡萄糖處理下，百子蓮總糖含量差異不顯著。麥芽糖處理下百子蓮總糖含量最高(圖3-A)；百子蓮淀粉含量的變化規(guī)律與總糖差異較大，蔗糖處理下淀粉含量相對(duì)較高，其中3 %蔗糖處理百子蓮淀粉含量最高(圖3-B)；百子蓮體胚組織內(nèi)蔗糖含量在3種糖類(lèi)濃度處理下呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，3 %濃度處理下百子蓮內(nèi)源蔗糖含量較低(圖3-C)；葡萄糖處理百子蓮內(nèi)源葡萄糖含量相對(duì)高，其中3 %葡萄糖處理顯著高于其他處理(圖3-D)；百子蓮麥芽糖的變化規(guī)律和總糖呈現(xiàn)出相似的規(guī)律，蔗糖處理下呈現(xiàn)梯度變化規(guī)律(圖3-E)；不同碳源處理下，百子蓮果糖含量的差異相對(duì)較小(圖3-F)。成熟胚發(fā)育階段糖代謝分析結(jié)果表明，總糖、淀粉、蔗糖與麥芽糖含量與成熟胚發(fā)育相關(guān)性較強(qiáng)。

2.4 不同糖濃度對(duì)百子蓮成熟胚發(fā)育內(nèi)源激素含量的影響

碳源對(duì)成熟胚激素代謝存在顯著影響(圖4)。蔗糖處理下，IAA含量與成熟胚數(shù)量變化趨勢(shì)相反，葡萄糖和麥芽糖處理下，IAA含量與成熟胚數(shù)量變化趨勢(shì)相同，而IAA-氧化酶活性和IAA含量的變化趨勢(shì)相反(圖4-A，圖4-C)。隨著碳源濃度的升高，GAs總量出現(xiàn)升高的趨勢(shì)(圖4-D)，GAs組分中GA3和GA4含量高于GA1；蔗糖處理下，GA1和GA4含量隨濃度的升高而升高，而GA3含量隨濃度升高而降低；葡萄糖處理下，GA4含量與成熟胚數(shù)量呈現(xiàn)相反的變化規(guī)律；麥芽糖處理下，GA1和GA3含量與成熟胚數(shù)量呈現(xiàn)相反的變化規(guī)律(圖4-E，圖4-G)。CTK和BR是除了生長(zhǎng)素和GA之外調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的重要激素，蔗糖和麥芽糖處理下，兩者含量變化呈現(xiàn)相反的規(guī)律(圖4-H，圖4-I)。蔗糖處理下，ABA含量相對(duì)較低，而葡萄糖和麥芽糖處理下，ABA含量相對(duì)較高(圖4-J)。乙烯、JA含量的變化幅度相對(duì)較小，且趨勢(shì)相似(圖4-K，圖4-L)。激素定量結(jié)果表明，生長(zhǎng)素、GA因具有梯度變化規(guī)律，在成熟胚發(fā)育過(guò)程中可能作用顯著。

2.5 不同糖濃度對(duì)百子蓮成熟胚發(fā)育活性氧含量及保護(hù)酶活性的影響

不同糖處理對(duì)活性氧及保護(hù)酶活性具有顯著影響(圖5)。ROS活性與成熟胚發(fā)育數(shù)量趨勢(shì)相似，在2 %蔗糖、2 %葡萄糖、3 %麥芽糖處理下相對(duì)較高(圖5-A)。蔗糖處理下，·OH含量整體上高于葡萄糖、麥芽糖，但不同濃度蔗糖處理·OH含量差異不顯著(圖5-B)。H2O2含量整體上隨著糖濃度增加而升高，葡萄糖處理下呈現(xiàn)梯度變化(圖5-C)。

保護(hù)酶活性變化幅度大于ROS及其組分，POD、CAT活性規(guī)律性相對(duì)較弱(圖5-D，圖5-E)。SOD活性隨著蔗糖濃度的升高而升高，但與成熟胚發(fā)育效果趨勢(shì)相反(圖5-F)。

3 討 論

除了光自養(yǎng)體系，碳源是植物離體培養(yǎng)中不可或缺的因素[15]。碳源可構(gòu)成細(xì)胞碳骨架，并為細(xì)胞呼吸代謝提供底物與能量[1]，植物對(duì)碳源的需求因種類(lèi)、基因型、發(fā)育階段均有差異[15]。本研究發(fā)現(xiàn)百子蓮體胚誘導(dǎo)及發(fā)育成熟階段對(duì)碳源濃度的需求分別為3 %和2 %，蔗糖可作為百子蓮S(chǎng)E體系的優(yōu)選碳源，葡萄糖利于體胚同步化，而麥芽糖效果較差，與山核桃(Caryacathayensis)基本一致[6]。蔗糖可通過(guò)改變培養(yǎng)基的滲透壓，使細(xì)胞失水，內(nèi)含物濃度升高，影響體細(xì)胞胚的數(shù)量及成熟[18]，例如內(nèi)源蔗糖的積累對(duì)荔枝(Litchichinensis)SE效率至關(guān)重要[19]。而在成熟胚的發(fā)育及生根過(guò)程中，低濃度的碳源可促進(jìn)淀粉向蔗糖的轉(zhuǎn)化，使體胚內(nèi)滲透壓升高，造成細(xì)胞吸水，致使代謝增強(qiáng)，另一方面，成熟胚發(fā)育過(guò)程中，較低的滲透壓利于根系從培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分。

碳源在體胚發(fā)生中起著重要作用，不僅為細(xì)胞分裂、分化提供能量，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，物質(zhì)運(yùn)輸，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)[15]。碳源種類(lèi)和濃度在體胚的發(fā)生和成熟發(fā)育階段代謝復(fù)雜[13,15]。趙舒野[20]發(fā)現(xiàn)蔗糖可以顯著提高胡桃楸(Juglansmandshurica)體胚發(fā)生，挪威云杉(Piceaabies)體胚成熟過(guò)程中，總可溶性糖的含量降低，蔗糖相對(duì)含量升高，利于成熟胚發(fā)育[21]，與本研究結(jié)果一致。也有研究表明麥芽糖由于分解較慢，可為體胚后期成熟階段提供更穩(wěn)定的能量供給，從而利于體胚發(fā)生[22]。淀粉的積累通常作為體胚發(fā)生中的重要事件，可在體胚發(fā)育過(guò)程中快速分解，為細(xì)胞旺盛分裂活動(dòng)提供能量[11,22]，例如荔枝(Litchichinensis)SE過(guò)程中，在淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶作用下，淀粉可轉(zhuǎn)化為蔗糖，滿(mǎn)足體胚發(fā)生物質(zhì)能量需求[19]。本研究中2 %蔗糖處理的淀粉含量顯著低于3 %、4 %蔗糖處理，內(nèi)源蔗糖含量顯著高于3 %蔗糖處理，而該處理成熟胚發(fā)育效果最佳，表明淀粉向蔗糖的轉(zhuǎn)化可能為體胚發(fā)育提供了充足的能量，而內(nèi)源蔗糖的積累對(duì)體胚發(fā)育更為關(guān)鍵[19]。

植物激素是自身合成與代謝的產(chǎn)物，調(diào)控細(xì)胞分化、生長(zhǎng)方向與進(jìn)程[23]。生長(zhǎng)素、GA、CTK、ABA、乙烯等對(duì)體胚誘導(dǎo)具有重要作用，但因物種而異[24]。本研究中生長(zhǎng)素、GA組分隨蔗糖濃度呈梯度變化，且與成熟胚誘導(dǎo)效果關(guān)系密切，其作用可能相對(duì)重要。雙子葉植物，例如寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)，體胚誘導(dǎo)時(shí)需要加入2,4-D[25]，而百子蓮等單子葉植物胚性誘導(dǎo)及維持則需加入PIC[9,16]。2,4-D和PIC均為外源激素類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)源IAA的合成與信號(hào)調(diào)控體胚發(fā)生[23,26]。IAA可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞極性誘導(dǎo)體胚形成，因此體胚誘導(dǎo)階段通常需要較高濃度的IAA，內(nèi)源IAA含量是調(diào)節(jié)體胚發(fā)生的主導(dǎo)因素[27-28]。本研究中，IAA在蔗糖處理下呈現(xiàn)梯度變化，濃度與成熟胚數(shù)量趨勢(shì)相反，可能是因?yàn)轶w胚誘導(dǎo)階段積累的IAA較多，而在體胚成熟發(fā)育階段，高濃度IAA對(duì)成熟胚發(fā)育不利，因?yàn)楦邼舛鹊腎AA會(huì)抑制頂端優(yōu)勢(shì)的形成，不利于成熟胚發(fā)育成植株。GA對(duì)體胚發(fā)生的效果因物種而異，多數(shù)研究表明高濃度GA對(duì)SE誘導(dǎo)不利[29-30]，本研究中，具有生物活性的GA1、GA4與成熟胚數(shù)量相反，與紫花苜蓿(Medicagosativa)[31]、天竺葵(PelargoniumhortorumBailey)[29]結(jié)果一致。

離體培養(yǎng)產(chǎn)生的氧化脅迫可導(dǎo)致代謝紊亂，甚至細(xì)胞死亡[32]。植物通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性清除ROS[33]。不適的糖種類(lèi)及濃度會(huì)對(duì)植物造成脅迫，而ROS和保護(hù)酶活性存在動(dòng)態(tài)平衡。在ROS類(lèi)別中，H2O2可影響基因表達(dá)，是非生物脅迫重要的信號(hào)分子之一[34-35]。中等強(qiáng)度的H2O2對(duì)棉花、牡丹(Paeoniasuffruticosa)離體培養(yǎng)有促進(jìn)作用[24,36]。蒔蘿(Anethumgraveolens)在愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚階段，H2O2含量持續(xù)上升，球形胚時(shí)期達(dá)到最高，而成熟胚時(shí)期含量下降[37]。在本研究中，H2O2含量隨糖濃度的升高而增加，SOD活性加強(qiáng)，而最終成熟胚發(fā)育效果隨糖濃度升高而降低，表明H2O2含量、SOD活性增強(qiáng)時(shí)脅迫相對(duì)嚴(yán)重，對(duì)成熟胚發(fā)育不利。

4 結(jié) 論

綜上，糖種類(lèi)及濃度顯著影響百子蓮體胚發(fā)生，蔗糖效果優(yōu)于葡萄糖和麥芽糖，其中3 %蔗糖利于體胚誘導(dǎo)，2 %蔗糖利于成熟胚發(fā)育。培養(yǎng)基碳源對(duì)體胚成熟發(fā)育期糖代謝、激素代謝及氧化脅迫具有顯著調(diào)節(jié)作用。淀粉與蔗糖之間的代謝平衡對(duì)百子蓮成熟胚發(fā)育具有決定作用；高濃度的IAA、GAs對(duì)成熟胚發(fā)育不利；H2O2、SOD不利于成熟胚發(fā)育。