張 超

(重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 萬州 404155)

【研究意義】草魚(Ctenopharyngodonidellus)是“四大家魚”之一，具有肉味鮮美、營養(yǎng)價值高、飼料來源廣泛、市場價格穩(wěn)定等特點，深受養(yǎng)殖戶和水產(chǎn)消費者的歡迎[1-2]。草魚是中國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高、養(yǎng)殖范圍最廣的養(yǎng)殖品種，據(jù)《2019中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》，2018年草魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到550.43萬噸[3]。隨著集約化養(yǎng)殖水平的提高，各種病害頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響了草魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，病害已經(jīng)成為關(guān)系草魚養(yǎng)殖成敗的瓶頸。因此，分離鑒定病原并采取有效的防治顯得尤為重要。2019年4月上旬，重慶萬州某養(yǎng)殖場出現(xiàn)草魚死亡病例，流行病學(xué)特征和臨床癥狀與已報道的草魚的病害差異較大[4]，亟需開展系統(tǒng)的病原分離鑒定?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對草魚為害較大的常見病為草魚出血病、細(xì)菌性爛鰓病、赤皮病、腸炎和細(xì)菌性敗血癥[4-5]。僅有草魚出血病能引起肌肉出血癥狀，但是，本文病例的流行病學(xué)特征和其他臨床癥狀與草魚出血病不符[4-5]。魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)是冷水性鮭科魚類的常見致病菌，典型癥狀為口腔出血和腸炎。該菌對大部分養(yǎng)殖的鮭鱒魚類都具感染性，并且能引起溫水性鯉科鰱、鳙魚發(fā)病[6]，但未見有侵染草魚的病例報道?！颈狙芯壳腥朦c】該病發(fā)病急，3日累計死亡率達(dá)10 %。典型癥狀表現(xiàn)為口腔點狀出血、肌肉出血、腸外壁點狀出血、鰾出血，脾臟呈醬紫色。發(fā)病日平均氣溫為22 ℃，病魚平均規(guī)格115 g，3日內(nèi)死亡量從開始的2～3尾增加到200多尾，病程持續(xù)1周，累積死亡率30 %左右，流行病學(xué)、臨床癥狀與已報道的草魚其他疾病存在明顯差異。【擬解決的關(guān)鍵問題】對重慶萬州某養(yǎng)殖場患肌肉出血癥的草魚進(jìn)行病原菌分離鑒定和藥敏試驗，闡明發(fā)病原因，為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病草魚取自重慶市萬州區(qū)某養(yǎng)殖場，健康草魚購自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場，規(guī)格大致與發(fā)病魚相同，暫養(yǎng)7 d后，隨機(jī)挑選進(jìn)行回歸感染試驗。TSA培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、藥敏檢測試劑盒、細(xì)菌微量生化鑒定管均購于杭州天和微生物試劑有限公司；RNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA回收試劑盒和DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 草魚呼腸孤病毒檢測

具體操作方法參考曾偉偉等[5]草魚呼腸孤病毒三重PCR檢測。

1.3 細(xì)菌分離與純化

將患病魚體表面用75 %酒精消毒，無菌操作取腦、肝、脾、腎劃線接種于TSA瓊脂平板上。培養(yǎng)基倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h[6]。選擇菌量較多、形態(tài)顏色一致的菌落，挑取單個菌落進(jìn)一步劃線培養(yǎng)[6]。純化后的菌株轉(zhuǎn)移到TSA瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。革蘭氏染色參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 細(xì)菌生理生化試驗

參照細(xì)菌生化微量鑒定管說明書和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]對病原進(jìn)行鑒定。

1.5 細(xì)菌16S rDNA基因序列分析

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待檢菌株的DNA。16S rDNA基因PCR擴(kuò)增引物參照分支桿菌[8]，反應(yīng)條件略有改動。正向引物為：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3′；反向引物為：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′。PCR反應(yīng)體系總量為50 μl，具體組成為：10×PCR緩沖液5 μl，MgCl2(25 mmol/L)5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.8 μl，正向引物和反向引物(20 μmol/L)各0.5 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl)1.2 μl，DNA模板5 μl，用無菌雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min，接下來94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，膠回收后克隆到T載體上，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。用NCBI-Blast進(jìn)行在線序列比對，用ClustalX 1.81進(jìn)行多重序列匹配和聚類分析，用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 回歸感染試驗

將市場上購買的健康草魚分成兩組，每組20尾，調(diào)整菌懸液濃度為4×107cfu/mL，攻毒組每尾胸鰭基部注射0.2 mL菌液，對照組注射0.2 mL的生理鹽水。將試驗魚放置于水溫為22～25 ℃的養(yǎng)殖箱中，每天觀察并記錄魚的發(fā)病和死亡情況，持續(xù)時間為2周。同時對瀕臨死亡或已死亡的魚進(jìn)行剖檢和病原菌的再次分離鑒定。

1.7 藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片擴(kuò)散法。取濃度為1.5×107cfu/mL的菌液0.2 mL均勻涂布于TSA瓊脂培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后觀察并記錄抑菌圈的直徑，敏感性判定參照試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病草魚特點及臨床癥狀

氣溫驟然升高后發(fā)病，發(fā)病日平均氣溫22 ℃，病魚平均規(guī)格115 g，3 d內(nèi)死亡量從開始的2～3尾增加到200多尾，病程持續(xù)1周，累計死亡率30 %左右。病魚癥狀：運(yùn)動能力差、體色異常、肌肉出血、鰭條基部出血、口腔廣泛性點狀出血，剖檢可見脾臟淤血腫大，呈醬紫色，腎臟和肝臟充血腫大，腸壁點狀出血，鰾出血(圖1)。

2.2 發(fā)病草魚呼腸孤病毒檢測

采用3種不同基因型的草魚呼腸弧病毒引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果均為陰性。草魚出血病的流行水溫為27～30 ℃，“紅肌肉型”多發(fā)于5～10 cm的草魚魚種，結(jié)合草魚呼腸孤病毒的流行病學(xué)和該病例的發(fā)病特點，可以排除草魚呼腸孤病毒感染。

A為肌肉出血、鰾出血；B為口腔點狀出血A. Muscle and bladder bleeding, B.Pointed oral bleeding圖1 病魚臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of diseased fish

2.3 病原分離株的形態(tài)特征

病原分離株的菌落形狀為圓形，表面光滑，邊緣平滑無凹凸，直徑大小約為1 mm，白色略透明。革蘭氏染色陰性，短狀桿，兩端呈圓狀，個別菌體相互連接成細(xì)絲狀(圖2)。

圖2 病原分離株的革蘭氏染色(×100)Fig.2 Gram staining of the isolate(×100)

2.4 病原分離株的生理生化特征

分離菌株在溫度18～36 ℃均能生長，最適宜生長溫度為24～31 ℃；在pH值4～10均能生長，最適生長的pH值范圍為5～8。細(xì)菌有運(yùn)動性，硫化氫反應(yīng)、V-P反應(yīng)陰性，能發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖。具體生理生化特征見表1，對照株參照范方玲等[9]。

表1 分離菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the isolate

2.5 病原分離株的16S rDNA基因序列分析

引物擴(kuò)增分離株的16S rDNA，獲得長度為1509 bp的特異性條帶(圖3)。通過NCBI-Blast同源性比對，發(fā)現(xiàn)病原菌的16S rDNA基因與魯氏耶爾森菌的同源性達(dá)99 %。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)序列，用ClustalX 1.81對序列進(jìn)行校正，采用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示病原菌與魯氏耶爾森菌聚為一支(圖4)。

2.6 健康草魚人工感染試驗

試驗組草魚在人工感染2 d后，出現(xiàn)活力下降，游動無力現(xiàn)象，鰭條基部開始有出血點呈現(xiàn)，口腔有斑點狀出血點，7 d內(nèi)發(fā)病草魚占攻毒草魚總數(shù)的70 %，而注射無菌生理鹽水的對照組未見異常(表2)。

表2 人工感染后草魚發(fā)病和死亡結(jié)果Table 2 Data about disease and death of grass carp after artificial infection

M為2000 DNA Ladder;1為分離株16S rDNAM=2000 DNA Ladder;1=16S rDNA of the isolate圖3 病原分離株的16S rDNA基因序列擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 16S rDNA of the isolate after being amplified by PCR

LY1904為分離株，細(xì)菌種名后的序號為 GenBank 登錄號LY1904 is the isolate. Serial numbers after the species name are GenBank accession number圖4 病原分離株的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the isolate based on 16S rDNA sequence

剖檢可見腸道斑點狀出血，鰾表面出血，與自然發(fā)病的草魚癥狀相似。再次分離到的菌株與原代菌株形態(tài)，生理生化性質(zhì)和16S rDNA序列分析一致，表明分離株為該病例的致病病原。

2.7 病原分離株的藥敏試驗

分離菌株對36種抗菌藥的敏感性表現(xiàn)：對青霉素G、苯唑西林、利福平、萬古霉素、克拉霉素、紅霉素、頭孢他啶、麥迪霉素、痢特靈存在耐藥性，對氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考等19種抗菌藥敏感(表3)。

表3 病原分離株的藥敏試驗結(jié)果Table 3 Antibiotic sensitivity test of the isolate

3 討 論

該草魚病例的典型癥狀為肌肉出血，發(fā)病水溫為17～22 ℃，疑似肌肉出血型草魚出血病，但是流行病學(xué)特點與草魚出血病不符[10]，通過草魚呼腸孤病毒三重PCR檢測也排除了病毒感染的可能，亦未見明顯的寄生蟲侵襲。從病魚的腦、肝、腎和脾中均分離到單一的菌落特征相同的革蘭氏陰性細(xì)菌，其形態(tài)和理化特征均與魯氏耶爾森菌較為符合[9, 11-13]。分離菌株經(jīng)16S rDNA PCR擴(kuò)增和序列測定，得到的片段大小為1509 bp，通過BLAST比對，與魯氏耶爾森菌的同源性最高，達(dá)99 %，人工感染試驗與自然發(fā)病的癥狀一致，表明魯氏耶爾森菌為該病例的致病病原。

魯氏耶爾森菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)耶爾森氏菌屬(Yersinia)，冷水性鮭鱒魚類為易感品種，典型癥狀為腸炎和“紅嘴”，常引起重大經(jīng)濟(jì)損失[14-17]。該病菌20世紀(jì)50年代首次分離自美國愛達(dá)荷州的養(yǎng)殖虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，當(dāng)前主要流行區(qū)域為加拿大、歐洲、美國南部、中東、中國、印度和澳大利亞，侵染魚類包括鮭鱒科魚類、鯉魚(Cyprinuscarpio)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、鱘魚(Acipenseriformes)、斑點叉尾鮰(Ictalunespunctatus)等，已成為養(yǎng)殖魚類主要病原菌之一[13, 18-21]。本研究首次從中國的養(yǎng)殖草魚病例中分離到一株魯氏耶爾森菌，發(fā)病癥狀和鰱、鳙較為相似，呈現(xiàn)典型的敗血癥癥狀，早期資料認(rèn)為魯氏耶爾森菌是淡水魚類細(xì)菌性敗血癥的主要病原[15]，本文的研究數(shù)據(jù)也證實了這一點。該病例還表現(xiàn)為肌肉出血，與草魚出血病癥狀較為相似，典型區(qū)別為前者肌肉呈暗紅色，后者呈鮮紅色，臨床上應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)特征進(jìn)行鑒別診斷[10, 15]。

本研究首次從中國的養(yǎng)殖草魚中分離到致病魯氏耶爾森菌，分離株對36種抗菌藥的敏感性結(jié)果為該病的臨床防治提供了參考。該菌對恩諾沙星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星敏感，這與范方玲等[9]和方蘋等[11]

的報道相同，與斑點叉尾鮰魯氏耶爾森菌[11]對卡那霉素的敏感性有很大的差異，這種差異可能是由菌株自身引起，也可能是養(yǎng)殖過程中使用可誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥性的藥物所致[22-25]?？偟膩碚f，對魯氏耶爾森菌病的治療應(yīng)采用恩諾沙星和氟苯尼考等水產(chǎn)常用抗菌藥，筆者臨床采用氟苯尼考對該病例進(jìn)行治療，獲得了較好的效果。該病發(fā)生的起始因素是水質(zhì)惡化，生產(chǎn)中應(yīng)定期對養(yǎng)殖水體進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，同時嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)管理，才能從根本上預(yù)防該病的發(fā)生。

4 結(jié) 論

通過系統(tǒng)的病原分離鑒定，確定引起該例草魚肌肉出血病的病原為魯氏耶爾森菌。魯氏耶爾森菌是冷水魚的主要致病菌，本研究首次從中國的養(yǎng)殖草魚中分離到致病魯氏耶爾森菌，該菌對青霉素G、苯唑西林、利福平、萬古霉素、克拉霉素、紅霉素、頭孢他啶、麥迪霉素、痢特靈存在耐藥性，對氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考等19種抗菌藥敏感，可選用恩諾沙星、氟苯尼考等水產(chǎn)類常用抗菌藥進(jìn)行防治。