鞏興龍，段夢琪，張 健，李雨晴，張芳芳，趙 雪，強(qiáng)巴央宗，商 鵬*

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2. 黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣一心鄉(xiāng)畜牧水產(chǎn)中心，黑龍江 大慶 163000)

【研究意義】動物產(chǎn)肉性能與肉品質(zhì)一直以來都是廣大育種工作者關(guān)注的熱點，從分子水平研究豬肌肉組織生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制將為育種工作提供新的突破口。肌酸激酶(CK)作為唯一的磷酸原激酶，是參與Cr+MgATP2-+ H+←→ PCr+MgADP-反應(yīng)的關(guān)鍵酶[1-3]，主要為肌肉收縮及運(yùn)動提供能量[4-6]。它有4 種同功酶形式，包括肌型 (MM-CK)、腦型 (BB-CK)、雜化型 (MB-CK) 和線粒體型 (Mi-CK/MtCK)[7]。其中CK肌型肌酸激酶(CKM)是一種組織特異性酶，存在于各種肌肉細(xì)胞中，參與細(xì)胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮以及三磷酸腺苷的再生[8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，CKM基因敲除小鼠的肌肉組織的ATP合成能力明顯增強(qiáng)[9]。CKM基因主要在骨骼肌和心肌中高表達(dá)[10-11]，集中在M線附近[12]，在腦、肺和一些癌細(xì)胞中低表達(dá)[13]，而骨骼肌的發(fā)育與動物的產(chǎn)肉能力以及生長發(fā)育具有重要關(guān)聯(lián)。有報道發(fā)現(xiàn)CKM基因在藏豬胚胎期背最長肌高表達(dá)，提出該基因與藏豬的慢生長和形態(tài)呈負(fù)相關(guān)[14]，意味CKM基因的高表達(dá)在藏豬中能抑制骨骼肌的生長發(fā)育以及降低藏豬的產(chǎn)肉能力?！颈狙芯康那腥朦c】本試驗主要探究CKM基因在藏豬和大約克豬的多態(tài)性以及在不同組織的表達(dá)水平?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步了解CKM基因在豬體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選擇西藏自治區(qū)林芝地區(qū)(海拔約2900 m)飼養(yǎng)的藏豬和大約克豬為研究對象。藏豬(TP)來源于西藏農(nóng)牧學(xué)院藏豬養(yǎng)殖基地，大約克豬(YY)來源于林芝宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地。共采集120 份耳組織(藏豬60 頭，大約克豬60 頭)，用于基因組DNA提取。選擇6 月齡大小的藏豬和大約克豬(各8 頭)進(jìn)行屠宰，分別采集肝臟、背最長肌及背脂組織各2 份，立即放入RNA保存液，液氮速凍，-80 ℃保存，用于總RNA提取。

1.2 DNA、RNA以及cDNA的制備與提取

采用苯酚氯仿抽提法從耳組織中提取基因組DNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop2000分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量，RNase-Free ddH2O溶解，-20 ℃保存。

利用RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0584S)提取試驗豬背最長肌、背脂和肝臟組織的總RNA。用Nano Drop2000分光光度計檢測RNA濃度和質(zhì)量，-80 ℃保存。

cDNA制備根據(jù)一步法cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR180123)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成體系見表1。

表1 cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系(20 μl)Table 1 System of cDNA first strand synthesis reaction

反應(yīng)程序：溫和吹打混勻，42 ℃延伸30 min，85 ℃保溫5 min終止反應(yīng)；cDNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA引物設(shè)計與合成

從NCBI網(wǎng)站中下載CKM基因(登錄號：NC_010448.4 )起始密碼子上游約3 kb區(qū)域DNA序列。使用 Premier 5.0軟件設(shè)計CKM基因的特異性引物，由上海生物工程有限公司合成，TE溶解，4 ℃保存。引物序列見表2。

表2 CKM基因 5’側(cè)翼區(qū)引物序列Table 2 Primer sequence of CKM gene 5 'lateral region

1.4 定量PCR引物設(shè)計與合成

1.4.1 熒光定量PCR引物設(shè)計與合成 從NCBI網(wǎng)站中下載已知豬的CKM基因的mRNA序列，使用Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量PCR擴(kuò)增引物，以β-actin基因為內(nèi)參基因，引物由上海生物工程有限公司進(jìn)行設(shè)計合成，TE進(jìn)行溶解，4 ℃保存，引物序列見表3。

表3 定量PCR引物序列 Table 3 Primer sequences for quantitative analysis

1.4.2 熒光定量結(jié)果計算方法 熒光定量PCR每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)，每個體系20 μl，含有1.0 μl cDNA，10.0 μl mix(Transgen)、7.8 μl ddH2O、正向和反向引物各0.6 μl(10.0 nmol/μl)。采用2-ΔΔCT方法計算CKM基因的mRNA水平。

ΔCT(樣品)=CT(樣品目的基因)-CT(樣品內(nèi)參基因)

ΔCT(標(biāo)準(zhǔn)樣)=CT(標(biāo)準(zhǔn)樣目的基因)-CT(標(biāo)準(zhǔn)樣內(nèi)參基因)

ΔΔCT=ΔCT(樣品)-ΔCT(標(biāo)準(zhǔn)樣)

目的基因表達(dá)量=2-ΔΔCT

1.5 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

從GeneBank下載CKM基因具有顯著突變位點的引物序列，利用在線軟件CONSITE (http://jaspar.binf.ku.dk/)，選擇脊椎動物，閾值設(shè)置80，把下載的突變前后的引物序列分別復(fù)制到軟件上，SCAN來預(yù)測SNPs位點突變前后轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的變化。

1.6 統(tǒng)計分析

對個體測序測得數(shù)據(jù)結(jié)果，使用Chormas Pro軟件對測序峰圖進(jìn)行分析，使用Excel軟件計算各突變位點的基因頻率和基因型頻率，使用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗分析基因型分布和基因型頻率的差異。對熒光定量結(jié)果，使用Excel進(jìn)行初步整理，使用SigmaPlot 10.0制備圖表，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

DNA提取結(jié)果顯示所提取的樣品DNA條帶比較清晰，無拖尾現(xiàn)象和其它雜帶的出現(xiàn)，未有蛋白質(zhì)的污染，說明提取的DNA沒有降解并且擁有良好的完整性，能夠滿下一步實驗需求，檢測結(jié)果見圖1。

圖1 豬基因組DNA凝膠電泳結(jié)果圖Fig.1 Pig genomic DNA gel electrophoresis results

2.2 RNA提取結(jié)果

所提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，組織總RNA的28 S、18 S兩條帶比較清晰，無拖尾現(xiàn)象和其它雜帶的出現(xiàn)，也未有蛋白質(zhì)和DNA雜質(zhì)的污染，說明各組提取的總RNA沒有降解并且擁有良好的完整性，能夠滿足后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和熒光定量的需要，檢測結(jié)果見圖2。

圖2 組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Tissue total RNA agarose gel electrophoresis

2.3 SNP篩選與基因分型

藏豬、大約克豬混池測序結(jié)果見圖3，在CKM基因起始密碼子上游3 kb區(qū)域發(fā)現(xiàn)2 個C/T突變，位于起始密碼子上游1185處和1324處，記為C-1185T和C-1324T。并對藏豬、大約克豬基因型頻率和基因頻率結(jié)果卡方檢驗進(jìn)行基因分型，經(jīng)檢驗CKM基因C-1185T和C-1324T位點均符合Hardy-Wein berg平衡(P>0.05)?；蛐皖l率和基因頻率及卡方檢驗結(jié)果見表4。

表4 CKM基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率Table 4 CKM gene polymorphism loci genotype frequency and gene frequency

圖3 CKM基因SNPs位點測序峰圖Fig.3 Sequencing chromatograms for the SNPs of CKM gene

2.4 CKM基因的mRNA表達(dá)

通過使用熒光定量PCR技術(shù)對CKM基因在藏豬和大約克豬各組織中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：在3個組織中，CKM基因在藏豬背最長肌的表達(dá)量最高，其次是背脂和肝臟。其中，在背最長肌中，CKM基因藏豬表達(dá)量極顯著高于大約克豬表達(dá)量(P<0.01)；在背脂中，CKM基因大約克豬表達(dá)量顯著高于藏豬表達(dá)量(P<0.05)；在肝臟組織中，CKM基因藏豬表達(dá)量極顯著高于大約克豬表達(dá)量(P<0.01)。

2.5 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

對SNPS位點進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CKM

*代表顯著性差異(P<0.05)，**代表極顯著差異(P<0.01)* Significant difference(P<0.05), ** Extremely significant difference(P<0.01)圖4 CKM基因在TP、YY 2個品種豬背最長肌、背脂、和肝臟中mRNA的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of CKM gene in longissimus dorsi,backfat and liver of TP and YY pigs

基因C-1185T位點突變前存在11 個轉(zhuǎn)錄因子，突變后存在10 個轉(zhuǎn)錄因子，其中6 個轉(zhuǎn)錄因子突變前后相同，較突變前5 個轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生變化，新增4個轉(zhuǎn)錄因子Erg、EHF、ELK4和SPIB；C-1324T位點突變前存在6 個轉(zhuǎn)錄因子，突變后存在10 個轉(zhuǎn)錄因子，較突變前3 個轉(zhuǎn)錄因子沒有發(fā)生變化，新增7 個轉(zhuǎn)錄因子TEAD1、En1、NFKB1、REL、FOXI1、Foxd3和Foxq1。

3 討 論

CKM是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的4 種肌酸激酶亞型之一 ，定位在6號染色體上，是肌肉發(fā)育和分化的標(biāo)志[15]，是骨骼肌能量代謝的關(guān)鍵酶之一，是細(xì)胞生長信號途徑中的重要成分。本研究在CKM基因起始密碼子上游3000 bp區(qū)域中發(fā)現(xiàn)突變位點C-1185T和C-1324T，該單核苷酸多態(tài)性位點的基因型頻率和基因頻率在藏豬和大約克豬中存在極顯著差異(P<0.01)。通過對這兩個突變位點進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)新增的轉(zhuǎn)錄因子大多與細(xì)胞生長發(fā)育、分化和代謝以及肢體發(fā)育密切相關(guān)，如轉(zhuǎn)錄因子Erg、EHF和En1，轉(zhuǎn)錄因子Erg對于胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞凋亡機(jī)制的調(diào)控均有重要作用[16]，轉(zhuǎn)錄因子EHF廣發(fā)存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等過程[17]，轉(zhuǎn)錄因子En1與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)，并在組織肌肉中持續(xù)表達(dá)[18]。揭示了這兩個多態(tài)性位點可能與肌肉的生長發(fā)育相關(guān)。

本研究通過對藏豬和大約克豬的背最長肌、背脂和肝臟進(jìn)行實時熒光定量檢測，發(fā)現(xiàn)CKM基因在背最長肌中的表達(dá)最高，且CKM基因在背最長肌的表達(dá)水平顯著高于背脂和肝臟組織。由此分析CKM基因在背最長肌中發(fā)揮重要作用。CKM基因在藏豬背最長肌中的表達(dá)水平極顯著高于大約克豬(P<0.01)，推測CKM基因在藏豬背最長肌中的高表達(dá)可能會抑制藏豬的肌肉發(fā)育及體型生長。這與商鵬研究發(fā)現(xiàn)CKM基因在豬胚胎發(fā)育期間肌肉組織的相對表達(dá)量在藏豬里面最高，烏金豬次之，大約克豬的表達(dá)量最低[14]結(jié)果相吻合。在本研究中，CKM基因在藏豬肝臟組織的mRNA表達(dá)水平顯著高于大約克豬(P<0.01)，肝臟調(diào)控機(jī)體代謝功能，基于CKM基因在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用，充分說明藏豬較大約克豬抗逆性強(qiáng)的特點[19]。CKM基因在藏豬和大約克豬的背脂表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.05)，推測可能與瘦肉型和脂肪型豬種有關(guān)。藏豬屬于脂肪性豬種，CKM基因的低表達(dá)促進(jìn)藏豬脂肪沉積，大約克豬屬于瘦肉型豬種，CKM基因在大約克豬背脂的高表達(dá)會抑制其脂肪沉積。具體分子調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步討論。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究通過對CKM基因起始密碼子上游3 kb區(qū)域進(jìn)行SNPs挑選，發(fā)現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性位點C-1185T和C-1324T，且該位點符合哈迪-溫伯格定律(P>0.05)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，CKM基因在藏豬和大約克豬存在顯著差異表達(dá)，尤其CKM基因在藏豬背最長肌中的mRNA表達(dá)量極顯著高于大約克豬(P<0.01)。CKM基因在不同品種3個組織的表達(dá)水平說明CKM基因與骨骼肌的生長發(fā)育呈負(fù)相關(guān)。本研究通過對CKM基因多態(tài)性及表達(dá)模式的分析，為進(jìn)一步研究CKM基因?qū)τ谪i的生長發(fā)育以及產(chǎn)肉能力提供理論依據(jù)，為藏豬種質(zhì)資源保護(hù)提供參考。