范寧波，楊 洋，鄢 敏，李林秋，嚴(yán) 素，易 蔓，楊懿德*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 四川省煙草公司宜賓市公司，四川 宜賓 644000)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)于2018年9月在河南省洛寧市取樣，實(shí)驗(yàn)材料為豫煙6號(hào)、豫煙10號(hào)和K326三個(gè)品種的煙葉，并于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。選擇地塊平整、肥力中等的煙田，前茬作物為小麥。試驗(yàn)地土壤為黃棕壤，施用肥料為煙草專用復(fù)合肥，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶1∶2。分別采收成熟度不同的豫煙6號(hào)、豫煙10號(hào)和K326的中部葉(自上而下第10～12位葉)，一部分煙葉在田間立即取樣用于NBT染色，另一部分煙葉放入干冰中及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，并置于液氮中及時(shí)妥善保存。

1.2 0.1 % NBT 染色

組織化學(xué)染色法可以方便快速地表征活性氧積累的程度和部位，我們參照并改進(jìn)譚冬梅的方法，使用NBT(氮藍(lán)四唑)染色法來(lái)表征煙葉中ROS的積累[9]。

選取不同成熟度的葉片，用直徑為10 mm的打孔器在葉片中部取樣(注意不要取到葉脈)，將樣品放入盛有0.1 % NBT 的10 mL離心管中，避光染色6 h 后取出。然后將染色后的葉片用75 %的酒精脫色，直至葉綠素完全降解以便于觀察，使用體視顯微鏡(Olympus SZX16)觀察并拍攝染色的葉片組織。

1.4 qRT-PCR分析

在田間取樣之后，用錫箔紙保存，并放置于干冰中妥善帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)基因的檢測(cè)。參考潘飛龍等人的方法使用qRT-PCR法測(cè)定活性氧相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量[13]。從NCBI 網(wǎng)站核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索煙草成熟衰老相關(guān)基因，并以煙草核糖體蛋白基因L25作為內(nèi)參基因[14]。利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列列表見(jiàn)表1。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。循環(huán)條件：在95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，在60 ℃退火及延伸30 s，一共進(jìn)行40次循環(huán)。按照顏彥等人的方法采用2- ΔΔCt [15]算法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 煙草葉片衰老相關(guān)基因qRT-PCR引物序列Table 1 Sequence list of qRT-PCR primers for tobacco leaf senescence-related genes

1.5 儀器

PCR 儀(ABI 9700)、熒光定量 PCR 儀(Roche LC480)、打孔器、離心機(jī)(Thermo Micro21R)、紫外分光光度計(jì)(美普達(dá) UV-1600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì))。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理并使用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(LSD)，利用Origin 2018進(jìn)行圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度煙草葉片細(xì)胞的NBT染色結(jié)果

2.2 不同成熟度條件下活性氧物質(zhì)含量的差異

圖1 不同成熟度煙葉的NBT染色結(jié)果Fig.1 NBT staining results at different maturity of tobacco leaves

圖2 不同成熟度煙葉中H2O2和含量的變化Fig.2 H2O2 and of tobacco leaves at different maturity

2.3 不同成熟度對(duì)煙葉中MDA含量的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，結(jié)果顯示，成熟過(guò)程中MDA的含量快速增加，但在不同品種間存在著一定的差異。MDA的含量表現(xiàn)為豫煙10號(hào)>豫煙6號(hào)>K326，且豫煙10號(hào)的MDA的含量均顯著高于其他2個(gè)品種(P<0.05)。豫煙10號(hào)適熟期MDA的含量比未熟時(shí)期增加了2.02倍，過(guò)熟時(shí)期MDA的含量相對(duì)于未熟時(shí)期增加了5.20倍；豫煙6號(hào)的煙葉在適熟時(shí)期MDA的含量比未熟時(shí)期增加了1.79倍，過(guò)熟時(shí)比起未熟時(shí)增加了4.59倍；隨著煙葉的成熟衰老，K326煙葉適熟時(shí)MDA含量增加了2.25倍，過(guò)熟時(shí)比起未熟時(shí)增加了6.41倍。這表明在煙葉成熟衰老過(guò)程中，隨著膜脂的氧化，細(xì)胞中的有毒物質(zhì)也在快速增加，且煙葉成熟之后細(xì)胞膜的氧化程度要遠(yuǎn)高于煙葉成熟之前(圖3)。

圖3 不同成熟度煙葉中MDA含量的變化Fig.3 MDA content of tobacco leaves at different maturity

2.4 煙草葉片成熟度對(duì)NtPSA1和CYP82E4相對(duì)表達(dá)量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，NtPSA1基因和CYP82E4基因在植物組織不同的發(fā)育階段中的表達(dá)量存在差異，因此可以有效地表征煙草葉片的衰老過(guò)程[17-18]。對(duì)豫煙6號(hào)、10號(hào)和K326 3個(gè)品種進(jìn)行qRT-PCR分析，以NtL25基因?yàn)閮?nèi)參基因，并以豫煙6號(hào)未熟時(shí)期的煙葉作為參照，計(jì)算這3個(gè)品種的煙葉在不同的成熟度情況下，NtPSA1和CYP82E4基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，隨著葉片成熟、衰老程度的增加，NtPSA1的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，而CYP82E4基因相對(duì)表達(dá)量卻呈逐漸增加的趨勢(shì)(圖4)。在未熟時(shí)期，3種煙葉之間的基因表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，在適熟期和過(guò)熟期，基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸開(kāi)始呈現(xiàn)顯著差異。

圖4 煙草葉片成熟度對(duì)基因NtPSA1和CYP82E4表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of tobacco leaf maturity on the expression of NtPSA1 and CYP82E4

3 討 論

NBT染色可以方便直觀地用于檢測(cè)葉片中活性氧的產(chǎn)生情況，煙葉在成熟、衰老的過(guò)程中也常常產(chǎn)生大量的活性氧，因此我們可以用此方法方便快捷地判斷煙葉的成熟度。本研究使用NBT染色法對(duì)不同成熟度的煙草葉片進(jìn)行染色，結(jié)果顯示豫煙6號(hào)、豫煙10號(hào)和K326煙葉在未熟階段時(shí)，葉片上的藍(lán)色沉淀均較少，但是隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，在適熟階段時(shí)煙葉上有明顯的染色痕跡出現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，到葉片的生長(zhǎng)后期即過(guò)熟衰老階段時(shí)，其染色斑面積更大，藍(lán)色沉淀幾乎要覆蓋整個(gè)煙葉樣品。我們的染色結(jié)果初步、淺顯地表明了隨著煙葉成熟度的增加，葉片中的活性氧物質(zhì)是逐漸增加的。

NtPSA1編碼26S 蛋白酶體的非催化型亞基，其在生長(zhǎng)旺盛的組織中表達(dá)量較高，而在衰老的葉片組織中表達(dá)量較低[17]。CYP82E4編碼P450蛋白，有研究表明，該基因伴隨葉片的衰老，其表達(dá)量逐漸增加[18]，本文的研究結(jié)果也表明，隨著煙葉成熟度的增加，NtPSA1的相對(duì)表達(dá)量逐步增加而CYP82E4的表達(dá)量逐步降低，這與前人的報(bào)導(dǎo)基本一致。

4 結(jié) 論

本研究探討了煙草葉片在不同的成熟度時(shí)期活性氧的代謝，通過(guò)化學(xué)染色、生理指標(biāo)、基因測(cè)定等方法鑒定了煙葉中活性氧物質(zhì)的積累。結(jié)果表明，伴隨著煙葉成熟度的增加，NBT染色程度逐漸增加，活性氧物質(zhì)逐步積累，衰老相關(guān)的基因其表達(dá)量也發(fā)生了顯著的變化。本文中所應(yīng)用的NBT化學(xué)染色法，可以方便快捷地衡量煙葉中活性氧物質(zhì)的積累，可以作為衡量煙草成熟度的參考指標(biāo)。