潘嘉林，林叢，周莉莉，黃明遠(yuǎn)，陳曄

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 溫州 325027

MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA。miRNA在幾乎所有的病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。miR-34a已被證明可以調(diào)節(jié)多種靶向蛋白，調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡等。與其他器官相比，miR-34a在心肌梗死后的心臟組織中高表達(dá)，這結(jié)果為研究慢性心力衰竭治療的新策略提供依據(jù)[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，沉默整個(gè)miR-34家族可以保護(hù)心肌梗死后心臟的病理性結(jié)構(gòu)重 構(gòu)[2]。但在心肌缺血的情況下，miR-34對(duì)心肌細(xì)胞的作用和具體機(jī)制目前尚未明了。本課題組前期研究表明，miR-34a在大鼠心肌梗死后的心肌細(xì)胞中表達(dá)增加，可能具有促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用[3]。本研究設(shè)計(jì)體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞，進(jìn)一步探討miR-34a是否通過Notch1通路調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡及其具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞株H9C2培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：恒溫37 ℃、1% O2、94% N2、5% CO2，平均3 d進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)染和分組 經(jīng)傳代培養(yǎng)后的H9C2細(xì)胞接種到6孔板中，再轉(zhuǎn)染5 μL的FAM-miRNA或siRNA，以Lipofectamine 2000（5 μL）為轉(zhuǎn)染介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)分6組：①miR-34a組：轉(zhuǎn)染miR-34a mimics；②miR-NC組：陰性對(duì)照細(xì)胞，轉(zhuǎn)染隨機(jī)合成NC microRNA片段；③miR-inhibitor組：轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor；④siRNA+miR-inhibitor組：先轉(zhuǎn)染siRNA-Notch1，再轉(zhuǎn)染miR-inhibitor；⑤siRNA-NC+miR-inhibitor組：先轉(zhuǎn)染隨機(jī)合成NC siRNA片段，再轉(zhuǎn)染miRinhibitor；⑥normal組：正常培養(yǎng)的細(xì)胞，作空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。

1.3 miR-34a mimics、miR-34a inhibitor和siRNA-Notch1片段的合成 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成。miR-34a mimics序列：正義鏈：5’-UGGCAGUGU CUUAGCUGGUUGU-3’，反義鏈：5’-AACCAGCUAAGACACUG CCAUA-3’；miR-34a inhibitor序列：5’-ACCGUCACAGA AUCGACCAACA-3’；siRNA-Notch1序列：5’-TTGGGACAGG UAUACCAAACA-3’。隨機(jī)合成的NC microRNA與NC siRNA大鼠基因組各基因均無顯著同源性。

1.4 RT-qPCR測(cè)定miR-34a的表達(dá) 各組體外培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，加TRIzol裂解細(xì)胞，氯仿萃取，用異丙醇濃縮過夜，提取總RNA，再用酶標(biāo)儀和甲醛變性凝膠電泳質(zhì)檢總RNA的純度和質(zhì)量，再取100 ng總RNA，應(yīng)用miRNA Isolation Kit分離小分子RNA，應(yīng)用miScript Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄合成c DNA，以ABI 7500 FAST型熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行定量PCR測(cè)定，檢測(cè)各組中miR-34a的含量。PCR條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用U6 RNA作為內(nèi)參，計(jì)算方法采用ΔΔCT（CT表示PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)）公式，miR-34a的ΔCTsample=CT sample-CT/U6 sample，ΔCT control=CT control-CT U6 control，ΔΔCT=ΔCT sample-ΔCT control）。

1.5 Western blot檢測(cè)caspase-3和Notch1的表達(dá) 各組體外培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，加蛋白裂解液（RIPA:PMSF=99:1）裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度，各組取30 μg蛋白行10% SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，再用含5%脫脂牛奶封閉1.5 h。 一抗[casp ase-3 antibod y（美國(guó)Abcam公司）1:1 000，Notch1 antibody（美國(guó)Abcam公司）1:500] 4 ℃孵育過夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min。室溫下加入IgG抗體（美國(guó)Abcam公司，1:4 000）孵育1.5 h，洗膜3次，每次10 min，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)選擇800通道進(jìn)行掃描條帶，以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)化caspase-3和Notch1蛋白質(zhì)表達(dá)，用AlphaEaseFC凝膠成像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡 細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用Annexin V-allophycocyanin（APC）染色（德國(guó)eBioscience公司）并使用FACScan流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)（美國(guó)BD公司）。H9C2細(xì)胞以約2.0×104/mL的密度接種在六孔板中，轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，用冰冷的PBS洗滌兩次，然后重懸細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞濃度至1×106/mL。再用Annexin V-APC在室溫黑暗中染色15 min，最后上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)測(cè)定靶基因 通過miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http://www.targetscan.org）預(yù)測(cè)到Notch1是miR-34a靶基因之一。分別克隆Notch1基因的野生型（WT）以及突變型（MUT）的3’UTR序列，并通過限制性內(nèi)切酶分別將兩個(gè)序列整合到PGL3-REPORT熒光報(bào)告載體中，構(gòu)建成PGL3-Notch1-WT和PGL3-Notch1-MUT兩個(gè)載體。實(shí)驗(yàn)分2 組：①WT組：將PGL3-Notch1-WT載體和miR-34a mimics同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以PGL3-Notch1-WT載體和miR-NC共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；②MUT組：將PGL3-Notch1-WT載體和miR-34a mimics同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以PGL3-Notch1-MUT載體和miR-NC共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。熒光素酶活性由熒光素酶報(bào)告試劑盒（美國(guó)Promega公司）測(cè)定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用 ±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-34a表達(dá)量比較 與miR-NC組比較，miR-34a組心肌細(xì)胞miR-34a表達(dá)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與miR-NC組比較，miRinhibitor組、siRNA+miR-inhibitor組和siRNANC+miR-inhibitor組miR-34a表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明H9C2細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了miR-34a mimics和miRNA inhibitor，見圖1。

圖1 各組miR-34a表達(dá)量

2.2 各組caspase-3和Notch1蛋白表達(dá)量比較 與miR-NC組比較，miR-34a組心肌細(xì)胞caspase-3的表達(dá)量明顯增多，Notch1的表達(dá)量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），miR-inhibitor組、siRNANC+miR-inhibitor組casp ase-3的表達(dá)量明顯減少，Notch1的表達(dá)量顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與siRNA-NC+miR-inhibitor組比較，siRNA+miR-inhibitor組caspase-3的表達(dá)量明顯增多，Notch1的表達(dá)量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），見圖2。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 各組凋亡率分別為：miR-34a組23.83%±3.54%，miR-NC組4.33%±0.56%，miR-inhibitor組2.84%±0.47%，siRNA+miR- inhibitor組18.96%±3.76%，siRNA-NC+miR- inhibitor組3.05%±0.49%，normal組4.67%± 0.63%。與miR-NC組比較，miR-34a組細(xì)胞凋亡率明顯增高，miR-inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與siRNA-NC+miRinhibitor組比較，siRNA+miR-inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖2 各組caspase-3和Notch1蛋白表達(dá)量

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)測(cè)定靶基因 通過targetscan靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)Notch1是miR-34a靶基因之一，見圖4A。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，與MUT組比，WT組miR-34a熒光活性明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4B。

3 討論

隨著老齡化的進(jìn)展，冠心病的發(fā)病率逐年增多，在其發(fā)生發(fā)展過程中，持續(xù)缺血極易導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死。近年來，一些miRNAs已經(jīng)被證明可以參與并調(diào)節(jié)急性心肌梗死病理生理發(fā)展的重要過程[4]。MiR-34家族在脊椎動(dòng)物中高表達(dá)，在細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[5]。MiR-34的表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，而miR-34a的過表達(dá)可抑制乳腺癌的發(fā)生[6]。在心臟的研究中發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死后循環(huán)中miR-34a水平顯著上調(diào)，而miR-34a水平與死亡和心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，提示miR-34a可能是預(yù)測(cè)左心室重構(gòu)的有用的生物標(biāo)志物[7]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，通過阻斷左前降支建立大鼠急性心肌梗死模型，miR-34a在梗死后的心肌組織中表達(dá)顯著增多[3]，而增多miR-34a可能參與心肌梗死后的心肌細(xì)胞凋亡。在其他研究中也觀察到了類似的結(jié)果，在急性心肌梗死患者和大鼠的血清中均觀察到miR-34a表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步證實(shí)miR-34a能促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的研究中也有miR-34a表達(dá)上調(diào)的報(bào)道，沉默miR-34a的表達(dá)可以緩解阿霉素的心臟毒性，對(duì)心臟具有保護(hù)作用[9]。在另一項(xiàng)研究中也表明，高齡小鼠心臟組織中miR-34a表達(dá)增加，導(dǎo)致心肌凋亡水平明顯升高[10]。這些研究均提示，心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-34a與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)，但具體機(jī)制目前尚未明了。

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)測(cè)定靶基因

將miR-34a mimics轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞上調(diào)miR-34a的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，caspase-3表達(dá)增多，細(xì)胞凋亡率顯著增加，而通過抑制轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor下調(diào)miR-34a的表達(dá)則得到相反的結(jié)果，表明miR-34a具有促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用。在高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，在高糖處理的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-34a過表達(dá)，miR-34a mimics抑制抗凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)，增加心肌細(xì)胞凋亡，并確定了bcl-2是miR-34a的靶基因[11]。在另一項(xiàng)關(guān)于干細(xì)胞治療缺血性心臟病的研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-34a抑制HSP70的表達(dá)，而后者被證明可以保護(hù)Sca-1干細(xì)胞，具有抗凋亡的作用，miR-34a的表達(dá)下調(diào)可以提高Sca-1干細(xì)胞的存活率[12]。因此，本研究結(jié)果提示miR-34a在心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

有研究顯示，miR-34a表達(dá)下調(diào)對(duì)心臟潛在保護(hù)作用是通過Wnt/catenin信號(hào)通路從而抑制梗死后心肌細(xì)胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染miR-34a mimics過表達(dá)miR-34a，則Notch1的表達(dá)顯著減少，細(xì)胞凋亡率明顯增加，而通過轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor下調(diào)miR-34a的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致相反的結(jié)果?？梢奛otch1的表達(dá)和與miR-34a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過Targetscan靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站信息了解到Notch1基因的3’UTR區(qū)有部分堿基與miR-34a完全互補(bǔ)配對(duì)，提示Notch1可能是miR-34a潛在靶基因之一，并用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。在卵巢癌細(xì)胞的研究也有報(bào)道，Notch1是miR-34的靶基因，miR-34家族促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和抑制癌細(xì)胞的侵襲作用機(jī)制可能與下調(diào)Notch1的表達(dá)有關(guān)[14]。在乳腺癌細(xì)胞研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-34a通過下調(diào)靶基因Notch1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[15]。在心臟和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究中也發(fā)現(xiàn)，Notch1的表達(dá)受miR-34a的調(diào)節(jié)[16]。 在先天性心臟病的研究也證實(shí)，miR-34a通過調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[17]。Notch1信號(hào)通路已被證明是凋亡相關(guān)通路之一，參與多種細(xì)胞的凋亡[18]。缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn)，Notch1信號(hào)通路受抑制，而細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Notch1具有心臟保護(hù)作用[19]。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor下調(diào)miR-34a的表達(dá)，則Notch1表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡減少，而用siRNA下調(diào)Notch1的表達(dá)，可阻斷miR-34a低表達(dá)引起的抗凋亡作用。類似的結(jié)論在另一項(xiàng)研究中也被證實(shí)，抑制miR-34a-5p可調(diào)節(jié)Notch1信號(hào)通路，從而保護(hù)心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。本研究表明，miR-34a調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡是通過靶定Notch1的作用實(shí)現(xiàn)的。這一結(jié)果進(jìn)一步闡明了miR-34a在參與缺血誘導(dǎo)的心肌凋亡方面的機(jī)制。

綜上所述，過表達(dá)miR-34a可抑制Notch1的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，下調(diào)miR-34a的表達(dá)可引起Notch1的表達(dá)增多，發(fā)揮抗凋亡的作用，熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)Notch1是miR-34a的靶基因。以上結(jié)果提示，miR-34a通過調(diào)節(jié)靶基因Notch1參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。