郭仲杰，蔡志欣，曾志恒，盧圓萍，陳美元，廖劍華

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014）

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的棕色蘑菇ARP088、MC441和白色蘑菇As2796，均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所遺傳育種研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然；

發(fā)酵棉籽殼試管培養(yǎng)基：發(fā)酵棉籽殼65%、發(fā)酵牛糞粉20%，麩皮12%、石灰1%，石膏1%、輕鈣1%、含水量65%；

培養(yǎng)料：二次隧道發(fā)酵的麥秸雞糞培養(yǎng)料；栽培種：自制的透氣袋小米栽培種。

1.3 方法

1.3.1 雜交技術(shù)

不育單孢菌株的分離、培養(yǎng)、鑒定和配對(duì)雜交技術(shù)，雜交菌株的篩選、鑒定方法均參考文獻(xiàn)[5～7]。

1.3.2 酯酶同工酶標(biāo)記測(cè)定

酯酶同工酶電泳樣品和聚丙烯酰胺凝膠制備、電泳方法和結(jié)果分析均參考文獻(xiàn)[8,9]。

1.3.3 生物學(xué)特性測(cè)定

⑴ 溫度試驗(yàn)

采用發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基法：將同一菌株接種于試管發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基，分別在5、10、15、20、25、30 ℃和35 ℃條件下培養(yǎng)，3個(gè)重復(fù)，觀測(cè)其走菌速率。

⑵ 含水量試驗(yàn)

采用發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基法：將同一菌株分別含水量為50%、55%、60%、65%、70%接種于試管發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基，25 ℃條件下培養(yǎng)，3個(gè)重復(fù)，觀測(cè)其走菌速率。

⑶ pH值試驗(yàn)

采用PDA培養(yǎng)基法：分別配制pH值為4、5、6、7、8、9和10的PDA平板培養(yǎng)基，將同一菌株接種于其中，25 ℃條件下培養(yǎng)，3個(gè)重復(fù)，觀測(cè)其走菌速率。

1.3.4 栽培篩選

⑴ 初篩試驗(yàn)

采用塑料筐栽培法，每筐栽培面積為0.17 m2，培養(yǎng)料填投量為100.0 kg/m2，栽培種播種量為1.0 L/m2，混播。每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，床架上隨機(jī)排列。

⑵ 復(fù)篩試驗(yàn)

采用床架式分區(qū)栽培法，每區(qū)栽培面積1.0 m2，培養(yǎng)料填投量為100.0 kg/m2，栽培種播種量為1.0 L/m2，混播。每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù), 床架上隨機(jī)排列。

⑶ 中試試驗(yàn)

采用空調(diào)控溫菇房床架式栽培法，每個(gè)菌株栽培面積100.0 m2，培養(yǎng)料填投量為100.0 kg/m2，栽培種播種量為1.0 L/m2，混播，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)。

在初篩、復(fù)篩和中試生產(chǎn)試驗(yàn)過程中，播種、覆土?xí)r間同步進(jìn)行，栽培管理按常規(guī)方式。分別觀察不同菌株的菌絲生長速率、農(nóng)藝性狀和產(chǎn)質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交選育

以酯酶同工酶為標(biāo)記，從棕色蘑菇ARP088分離出不育單孢菌株10株；從白色蘑菇As2796分離出不育單孢菌株29株，配對(duì)雜交，獲得雜交新菌株36株。其中M026是不育單孢菌株ARP088-S9與As2796-S1雜交獲得新雜交菌株。

2.2 生物學(xué)特性

2.2.1 溫度試驗(yàn)

測(cè)定結(jié)束后，將5 ℃和35 ℃條件下的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接開PDA平板培養(yǎng)基上，5 ℃條件下的接種塊重新蔭發(fā)走菌；35 ℃條件下接種塊沒有蔭發(fā)。雜交新菌株M026菌絲生長的溫度試驗(yàn)結(jié)果見表 1。不同溫度的菌絲生長試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交新菌株M026的菌絲生長溫度范圍為10～35 ℃，適宜生長溫度為25 ℃，休眠溫度為5 ℃，致死溫度為35 ℃。

表1 不同溫度下M026菌絲生長速率

表2 不同含水量下M026菌絲生長速率

表3 不同pH值培養(yǎng)基下M026菌絲生長速率

2.2.2 含水量試驗(yàn)

雜交新菌株M026菌絲生長的含水量試驗(yàn)結(jié)果見表2。不同含水量的培養(yǎng)基的菌絲生長試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交新菌株M026的菌絲生長的適合范圍為50%～70%，適宜生長的范圍為50%～65%。

2.2.3 pH 值試驗(yàn)

在不同pH值的平板培養(yǎng)基上，雜交新菌株M026的菌絲生長試驗(yàn)結(jié)果表3。

不同pH值的平板培養(yǎng)基菌絲生長試驗(yàn)結(jié)果表明：雜交新菌株M026的菌絲在PDA平板上生長的pH值范圍為5～10，適宜生長平板pH值為7。

2.3 同工酶標(biāo)記鑒定

雜交新菌株M026的酯酶同工酶標(biāo)記鑒定結(jié)果見圖1。

雜交新菌株W192的酯酶同工酶表型為HG5型，呈典型的雜合態(tài)。

2.4 栽培篩選

2.4.1 初篩試驗(yàn)

根據(jù)子實(shí)體的顏色，淘汰了白色或米黃色菌株；根據(jù)子實(shí)體單粒重量和菌蓋平均直徑，淘汰了3株朵形較小的菌株，同對(duì)照菌株MC441的單位平均產(chǎn)量相比較，淘汰了產(chǎn)量低的菌株，優(yōu)選部分雜交棕色菌株進(jìn)入復(fù)篩試驗(yàn)。

圖1 雜交新菌株M026的酯酶同工酶圖譜

2.4.2 復(fù)篩試驗(yàn)

部分復(fù)篩雜交菌株的出菇、產(chǎn)量和單粒重的結(jié)果見表5。

表5 部分復(fù)篩參試菌株的出菇、產(chǎn)量和單粒重表

表6 中試試驗(yàn)菌株的子實(shí)體農(nóng)藝性狀

表7 中試試驗(yàn)菌株的出菇、產(chǎn)量和單粒重結(jié)果

初篩優(yōu)選出的菌株經(jīng)過復(fù)篩比較試驗(yàn)的結(jié)果表明，雜交新菌株M026與對(duì)照MC441相比較，產(chǎn)量提高了14.4%，單粒重量提高8.8%。

2.4.3 中試試驗(yàn)

中試菌株的子實(shí)體農(nóng)藝性狀結(jié)果見表6，出菇、產(chǎn)量和單粒重結(jié)果見表7。

在中試試驗(yàn)中，棕色蘑菇雜交新菌株M026菌蓋呈棕色、圓整厚實(shí)，采摘后沒有褐變，菌柄長度直徑適中；子實(shí)體單生，管理方便；與對(duì)照MC441相比較，產(chǎn)量提高12.4%，單粒重量提高13.0%。

3 討論

雙孢蘑菇新菌株的選育方法主要采用不育單孢分離雜交技術(shù)，該技術(shù)在白色雙孢蘑菇新品種選育上運(yùn)用非常成熟，而國內(nèi)棕色蘑菇的選育少有運(yùn)用不育單孢分離雜交技術(shù)的報(bào)道。

本研究運(yùn)用單孢分離雜交技術(shù)雜交出新棕色菌株，通過酯酶同工酶標(biāo)記鑒定，出菇栽培篩選方法，得到了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新棕色菌株M026，為改變我國蘑菇栽培品種長期以來單一白色品種的局面和商品多元化做了前期探索。由于棕色蘑菇種質(zhì)資源少，在棕色蘑菇不同菌株內(nèi)進(jìn)行雜交育種，雜交范圍窄，存在較難獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的遺傳的可能性。今后運(yùn)用白色雙孢蘑菇與棕色蘑菇進(jìn)行雜交育種，是棕色蘑菇新品種選育新途徑。