周凱 盧宇 袁慧軍 瞿申紅 陸秋天 黃蘭誠 林鉆平，5 唐鳳珠

作者單位：1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸科 南寧 530021

2 廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院 南寧 530021

3 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心 重慶 400038

4 四川大學(xué)華西醫(yī)院罕見病研究院 成都 610041

5 桂林醫(yī)學(xué)院研究生院 桂林 541004

Perrault綜合征(perrault syndrome，PRLTS)是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，其特征是女性卵巢發(fā)育不良和男/女性感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss，SNHL）[1]。PRLTS的臨床表現(xiàn)具有高度的異質(zhì)性，還可能合并共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、小頭畸形、癲癇、生長發(fā)育遲緩和智力障礙等表現(xiàn)。PRLTS根據(jù)致病基因不同可以分為6種亞型，分別由HSD17B4、HARS2、CLPP、LARS2、TWNK、ERAL1基因突變所導(dǎo)致[2～4]，其中CLPP基因突變所導(dǎo)致的疾病稱為PRLTS 3型[1]。迄今為止，CLPP基因已有14個致病性突變被報道[5～11]，國內(nèi)尚未見CLPP基因突變導(dǎo)致PRLTS的相關(guān)報道。本研究通過耳聾基因靶向測序在一個臨床診斷為PRLTS家系的2名患者中檢測到CLPP基因的兩個新發(fā)變異，明確了該家系致病原因，為多系統(tǒng)癥狀的診治提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 家系資料

本家系的研究經(jīng)過陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，由患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。對家系成員進(jìn)行詳細(xì)問詢，包括耳聾相關(guān)病史、腎病家族史、既往史、耳毒性藥物史、女性月經(jīng)史以及外傷史等。

1.2 方法

1.2.1 聽力學(xué)檢查及表型鑒定 先證者及家系成員進(jìn)行聽力學(xué)檢查，包括純音測聽和聲導(dǎo)抗檢查等。對患者進(jìn)行常規(guī)查體、聽力檢查和耳科?？茩z查等。根據(jù)家系調(diào)查和聽力學(xué)結(jié)果繪制系譜圖。

1.2.2 耳聾基因靶向測序 采用由袁慧軍團(tuán)隊研發(fā)的耳聾基因大規(guī)模平行測序方法對受檢對象的158個耳聾致病基因進(jìn)行檢測，其中包括已知非綜合征型耳聾基因和常見綜合征型耳聾基因。用安捷倫公司定制目標(biāo)區(qū)域捕獲試劑盒（agilent technologies，santa clara，CA，USA），根據(jù)試劑盒說明書 進(jìn)行基因組DNA建庫，捕獲158個基因的所有外顯子、側(cè)翼區(qū)內(nèi)含子和剪接區(qū)域。精確定量后，在Illumina HiSeq 2000分析儀上對捕獲的DNA片段進(jìn)行測序。按照標(biāo)準(zhǔn)Illumina程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)處理。使用BWA軟件包（http：//bio-bwa.sourceforge）將測序所得短片段序列與GRCh37/hg19參考基因組數(shù)據(jù)集比對，識別可能影響蛋白質(zhì)功能的非同義變異，候選變異通過公共數(shù)據(jù)庫和內(nèi)部外顯子組數(shù)據(jù)庫中等位基因頻率小于0.005進(jìn)行篩選。對新發(fā)現(xiàn)罕見變異的患者，收集家庭成員信息和血樣，通過Sanger測序?qū)蜻x變異進(jìn)行基因分型及共分離分析。

1.2.3 變異驗證 全部家系成員的驗證：參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫（GRCh37）針對CLPP基因檢出的變異設(shè)計引物序列（見表1），PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：a.95℃預(yù)變性2分鐘，b.95℃變性30秒，退火溫度62～58℃，c.每個循環(huán)降0.5℃，退火30秒；d.72℃延伸30秒，擴(kuò)增30個循環(huán)后，e.72℃再延伸2分鐘，最后10℃保存，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行sanger測序分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)及聽力結(jié)果

該家系共2代5人（1人已故，4人在世），Ⅱ-2為女性，現(xiàn)年16歲，純音測聽提示雙耳平均聽閾大于100 dB HL，表現(xiàn)為雙耳極重度NSHL（見圖1），且有明顯的智力障礙表現(xiàn)，合并四肢肌無力，平衡功能及乳房發(fā)育差，月經(jīng)初潮年齡推遲（目前尚未月經(jīng)初潮）等生殖系統(tǒng)發(fā)育異常表現(xiàn)。Ⅱ-3為男性，現(xiàn)年14歲，雙耳平均聽閾大于100 dB HL，表現(xiàn)為雙耳極重度NSHL（見圖2），合并癲癇，平衡功能差，智力及生殖系統(tǒng)發(fā)育未見明顯異常，頭顱MRI提示腦白質(zhì)病變，雙側(cè)小腦溝增寬，腦電圖結(jié)果為成人中度異常腦電地形圖，基本節(jié)律慢化，癇電發(fā)放。其父母(I-1，I-2)聽力均正常，智力及生殖系統(tǒng)未見明顯異常，家系分析符合常染色體隱性遺傳特征（見圖3），患兒父母否認(rèn)近親婚配，且無耳聾、智力障礙家族史。

2.2 耳聾基因檢測結(jié)果

耳聾基因大規(guī)模平行測序結(jié)果表明，2名患兒均為CLPP基因c.661G＞T和c.328delA復(fù)合雜合變異。

2.3 Sanger測序驗證及家系內(nèi)驗證

家系成員Sanger測序結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致，2名患兒CLPP基因c.661G＞T和c.328delA位點的復(fù)合雜合變異，患兒父母分別攜帶CLPP基因c.661 G＞T和c.328 delA位點的雜合變異（見圖4、5）。

2.4 變異致病性分析

在gnomAD人群數(shù)據(jù)庫未見CLPP基因c.661G＞T和c.328delA變異報道，經(jīng)查詢自建數(shù)據(jù)庫中7202例中國聽力正常成年人的外顯子組數(shù)據(jù)，為新的罕見變異。CLPP基因c.661G＞T（p.Glu221Ter）和c.328delA（p.Ser110AlafsTer17）分別為無義變異和移碼變異，根據(jù)ACMG變異解讀標(biāo)準(zhǔn)將CLPP基因c.661G＞T和c.328delA突變位點均判定為致病性變異。

3 討論

本研究通過高通量耳聾基因靶向測序，在一個PRLTS家系中發(fā)現(xiàn)CLPP基因c.661G＞T和c.328delA復(fù)合雜合突變致病，為本研究新發(fā)現(xiàn)的兩個致病性變異。該家系中男性患者表現(xiàn)為耳聾合并癲癇，平衡功能差，但智力及生殖系統(tǒng)發(fā)育未見異常，女性患者表現(xiàn)為耳聾合并智力障礙，四肢肌無力，平衡功能差以及乳房發(fā)育差、月經(jīng)初潮年齡推遲（目前尚未月經(jīng)初潮）等生殖系統(tǒng)發(fā)育異常表現(xiàn)。與PRLTS 3型描述的表型相一致[1]。

CLPP基因包含6個外顯子，編碼的ClpP是一種ATP依賴性蛋白酶，通過N端靶向序列定向到線粒體基質(zhì)[12～14]。Kang等[15]通過電子顯微鏡確定純化的重組人ClpP和ClpX分別形成七聚體和六聚體環(huán)，2個ClpP七聚體環(huán)和2個ClpX六聚體環(huán)組成ClpXP復(fù)合體，分解異常折疊的蛋白質(zhì)。ClpX決定復(fù)合物的底物特異性，展開異常蛋白并將其送入ClpXP復(fù)合體形成的腔中，在ATP存在下分解蛋白，平均產(chǎn)物長度為10個殘基，這些產(chǎn)物被外肽酶進(jìn)一步降解為游離氨基酸。

表1 Sanger 測序引物

圖1 Ⅱ-2純音測聽結(jié)果

圖2 Ⅱ-3純音測聽結(jié)果

圖3 PRLTS家系圖：基因型與表型共分離

圖4 c.661G>T野生型（WT）和突變型（Mut）反向Sanger測序驗證峰圖

圖5 c.328delA野生型（WT）和突變型（Mut）反向Sanger測序驗證峰圖

CLPP基因突變改變ClpXP復(fù)合體形成的桶形腔的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致不穩(wěn)定的ClpP，其半衰期縮短，細(xì)胞ClpP水平降低，損害異常折疊的線粒體蛋白的分解，線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)異常，導(dǎo)致線粒體功能障礙[12，16]，對CLPP基因高表達(dá)的組織器官影響明顯，這些變化是如何導(dǎo)致Perrault綜合征尚不明確。Gispert等[16]通過基因敲除獲得了Clpp-/-小鼠，存活的基因敲除鼠和同窩野生型小鼠在哺乳期體重相仿，此后其體重增加較慢，成年后基因敲除鼠的體重小于野生型小鼠。雌、雄的Clpp-/-小鼠完全不育，表現(xiàn)出自發(fā)的運動活動減少、耳聾，并且比野生型更早地自然死亡。

Jenkinson等[17]首次報道了一個來自英國-巴基斯坦的近親家庭（PDF1）的3名患PRLTS的姐妹，在先天性極重度SNHL的基礎(chǔ)上均表現(xiàn)出不同程度的卵巢發(fā)育異常。Jenkinson等[6]通過連鎖分析、純合子定位和外顯子測序，確定了該家系的致病原因為CLPP基因第4號外顯子c.433A＞C（p.thr145pro）純合突變，該突變發(fā)生在頭部區(qū)域中第1個β折疊的β-3鏈內(nèi)高度保守的殘基處。該突變與疾病在家系中共分離，在193個同族對照和NHLBI Exome Variant Server (ESP6500)數(shù)據(jù)庫中均未發(fā)現(xiàn)。除了嚴(yán)重的先天性感音神經(jīng)性聽力喪失和卵巢早衰外，3個姐妹還表現(xiàn)出身材矮小、小頭畸形、癲癇發(fā)作、中等程度的學(xué)習(xí)困難以及小腿和小腦共濟(jì)失調(diào)并伴有下肢痙攣等癥狀。這些表現(xiàn)與本研究報道的先證者表型高度重合。

CLPP基因迄今為止已有10余個與耳聾相關(guān)的突變位點被報道。本研究報道了2個PRLTS患者CLPP基因兩個新的變異c.661G＞T和c.328delA，經(jīng)sanger測序驗證以上兩個突變分別來自患者父親和母親，且父母雙方聽力正常，無其他綜合征表現(xiàn)，符合常染色體隱性遺傳模式，在gnomAD等人群數(shù)據(jù)庫中未見報道。CLPP基因c.328delA（p.Ser110AlafsTer17）為移碼突變，引起翻譯蛋白質(zhì)截斷。c.661G＞T（p.Glu221Ter）為無義突變，使得肽鏈合成提前終止，肽鏈長度變短。兩種截斷突變均有可能引發(fā)無義介導(dǎo)的mRNA降解，從而沒有蛋白質(zhì)產(chǎn)物。根據(jù)ACMG變異解讀標(biāo)準(zhǔn)將CLPP基因的兩個新發(fā)變異位點c.661G＞T和c.328delA突變位點均判定為致病變異。

PRLTS男性患者可能僅表現(xiàn)為耳聾，但女性患者則常合并卵巢發(fā)育不良。本研究通過基因診斷明確了該家系的耳聾患者為PRLTS，該家系中兩名患者年齡較小，女性患者除耳聾表型外，還存在智力障礙，運動功能差等表現(xiàn)，在女性特征方面，患者目前雙側(cè)乳房發(fā)育差，且尚未出現(xiàn)月經(jīng)初潮，這提示卵巢功能發(fā)育不良可能性大，需提示父母注意相關(guān)表型，及時到專科就診。男性患者除耳聾表型外，合并癲癇發(fā)作，運動、平衡功能發(fā)育較差，表現(xiàn)為走路不穩(wěn)、易摔跤、無法完成跳繩、跳遠(yuǎn)等動作。

綜上所述，在中國PRLTS家系中發(fā)現(xiàn)CLPP基因的兩個新發(fā)變異位點c.661G＞T和c.328delA為尚未報道的致病變異，該位點的報道擴(kuò)大了CLPP基因的突變譜，明確了致病原因，為多系統(tǒng)癥狀的診治提供了指導(dǎo)，為該家系提供了臨床遺傳咨詢。