王 榮，喬改霞，檀鵬霞，段 偉，梁振昌，范培格,4

（1 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）（2 中國科學(xué)院植物研究所）（3 種苗生物工程國家重點實驗室）（4 中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院）（5 石家莊農(nóng)業(yè)學(xué)校）

葡萄是世界上最重要的經(jīng)濟水果之一，在世界果類產(chǎn)品貿(mào)易中占據(jù)著重要的位置[1-2]。中國已成為世界上的葡萄生產(chǎn)大國，但由于自然環(huán)境因素等的限制，我國還不是世界上的葡萄生產(chǎn)強國[3]。我國北方大部分葡萄產(chǎn)區(qū)主要為大陸性季風(fēng)氣候，冬季寒冷干旱，葡萄凍害時有發(fā)生[1,4-9]。凍害會嚴重影響葡萄的生長發(fā)育，造成葡萄的品質(zhì)變劣、產(chǎn)量下降，甚至凍害發(fā)生嚴重的年份，葡萄樹整株死亡，造成葡萄園缺苗斷壟現(xiàn)象十分普遍[6-7]。生產(chǎn)上常采用埋土防寒的措施來實現(xiàn)葡萄安全越冬，這樣不但會大幅度地增加生產(chǎn)成本，還會對葡萄樹體造成傷害，而且埋土出土也會造成沙塵現(xiàn)象，加重生態(tài)環(huán)境惡化[8-10]。因此，進行葡萄抗寒育種，選育出適合我國北方氣候條件的高耐寒的葡萄新品種對我國葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義，而對葡萄的雜交后代進行抗寒性鑒定與評價則是抗寒育種的一項重要環(huán)節(jié)[10-14]。

關(guān)于葡萄不同品種的抗寒性鑒定及與抗寒性相關(guān)的生理生化指標的研究已有諸多報道[10,13-20]。常用的葡萄抗寒性鑒定方法有田間自然鑒定法、組織變褐法、電導(dǎo)法、恢復(fù)生長法、低溫放熱法以及綜合評價法等[10,14,19-20]。其中，低溫放熱法在植物抗寒性的評價當中已有較多的應(yīng)用[21-28]，并且在葡萄的抗寒研究中日趨成熟[5-6,28-34]。葡萄一般測定冬芽主芽的LTE 值來評價其抗寒能力的強弱[35]。此外葡萄枝條上芽段萌發(fā)率也能很直觀地反映出葡萄的抗寒能力，可用來鑒定不同葡萄品種的抗寒性能[36-41]。葡萄組織體內(nèi)束縛水與自由水所占的比例也與其抗寒性強弱有著密切的關(guān)系[12,19,41-44]。因此，將束縛水與自由水的比值作為評價葡萄抗寒性的指標是較可靠的，但是僅用單一的指標難以客觀準確地反映出不同品種的抗寒能力，所以試驗中經(jīng)常會采用多種鑒定方法或多個與抗寒性相關(guān)的理化指標，結(jié)合隸屬函數(shù)法、主成分分析法等多種統(tǒng)計方法來綜合評價不同品種的抗寒性[13-14,36,45-47]。

本研究對露地越冬且經(jīng)過冬季田間自然低溫脅迫后的雜交后代及其親本，測定其枝條總含水量、自由水及冬芽LTE 值、萌芽率，并應(yīng)用隸屬函數(shù)法綜合評價種間雜交后代的抗寒性，以篩選出高抗寒的優(yōu)良雜種單株，為進一步選育高抗寒的優(yōu)良葡萄品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為中國科學(xué)院植物研究所葡萄種質(zhì)資源圃（北京）中保存的145 株‘北紅’×7-11-49雜交后代，以母本‘北紅’（Vitis vinifera‘Muscat Hamburg’ ×V.amurensis）和父本 7-11-49｛［Minnesota78（V.labrusca‘Beta’×Witt）×V.riparia］×V.vinifera‘Chenin Blanc’｝為對照。試驗材料全部不埋土露地越冬。2020 年1 月15 日左右，挑選長勢一致的葡萄枝條，從第三節(jié)間剪下葡萄枝條，每個雜種單株剪5 根枝條，用保鮮膜包裹，做好標記后置于4 ℃的冷庫中臨時保存。

1.2 試驗儀器

電子天平；電熱鼓風(fēng)干燥箱；數(shù)顯糖度計（APS90）；DTA 系統(tǒng)由程序控制冰箱（T2C）和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（2700-DAQ-40）2 部分組成。程序控制冰箱模擬自然降溫。數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)有4 層PVC 板，每層PVC 板上有9 個電熱模塊，每個PVC 板均配置熱敏電阻式溫度傳感器，記錄芽體放熱過程中每個熱電模塊中溫度的變化，并將其轉(zhuǎn)換成電壓（mV）形式輸出。數(shù)據(jù)采集器每隔15 s 采集1 次從溫敏電阻及熱電模塊中傳出的電阻及電壓變動數(shù)據(jù)，電阻值（R）經(jīng)由公式轉(zhuǎn)換為樣品盤的實時溫度［T（℃）=-0.007 742×R+106.5］，結(jié)合Excel LINX 程序，在Excel 中完成響應(yīng)溫度下的電壓變動圖[10]。

1.3 試驗方法

1.3.1 枝條總含水量的測定

測定方法參照鄒琦的烘干法[48]。將保存的1 年生成熟枝條剪截成長5～8 cm 的不含芽枝段，枝段每3 段為1 組進行逐一編號，每個單株重復(fù)5 組，精確稱重，記為Wf（組織鮮重）；然后將其置于烘箱中，在105 ℃烘30 min 殺青，之后再置于80 ℃烘至恒重，稱其重量記為Wd（組織干重）。

枝條總含水量（%）＝［（Wf－Wd）/Wf］×100

1.3.2 枝條自由水及束縛水的測定

自由水測定參照潘瑞熾的方法[49]。取出10 mL型號的離心管，逐一編號，并將空離心管放在天平上準確稱重，記錄為W1，將枝條避開芽眼用刀片切成0.1 cm 厚的薄片，每個重復(fù)準確稱取0.5 g，放入對應(yīng)試管稱量，記錄為W2，將配好的65%蔗糖迅速加入每個離心管中，每管加5 mL，再稱重記錄為W3，塞緊試管，以免水分散失，置于暗處放置6～8 h，其間不時輕輕搖動，用數(shù)顯糖度計測定各試管蔗糖溶液濃度，每個單株重復(fù)5 次。

枝條自由水含量（%）=｛（W3－W2）×［（C1－C2）/C2］/（W2－W1）｝×100

式中：W2－W1為枝條鮮重（g）；W3－W2為糖液原重量（g）；C1為糖液原濃度（%）；C2為浸泡后糖液濃度（%）。

枝條束縛水含量（%）=枝條總含水量－枝條自由水含量

束自比=束縛水含量/自由水含量

1.3.3 葡萄冬芽LTE 的測定

測定方法參照柴風(fēng)梅等的報道[50-51]。取芽位置為4～8 節(jié)位，并且選擇飽滿的芽體，垂直芽體中軸線下刀，僅帶0.5～1.0 mm 厚的木質(zhì)部組織，切面平整。將切好的芽體放入有潮濕吸水紙的培養(yǎng)皿中。在電熱模塊中放好薄紙片，加入150 μL dH2O，每個電熱模塊中放入6 個芽體，每個單株重復(fù)放3個電熱模塊，芽切面向下。蓋上海綿，輕壓使切面與電熱模塊緊密接觸。將固定好的PVC 板置于程序控制冰箱降溫，降溫程序為：室溫至-4 ℃，30 min；-4 ℃保持1 h；-4 ℃至-40 ℃，降溫速度4 ℃/h，共需10 h；-40 ℃保持1 h；45 min 內(nèi)升溫至4 ℃。數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)每隔15 s 采集1 次溫度數(shù)據(jù)，芽的致死溫度為低溫放熱高峰出現(xiàn)時所對應(yīng)的氣候室溫度值。

1.3.4 枝條萌芽率試驗

測定方法參照喬改霞等的報道[41]。取經(jīng)過低溫脅迫的枝條，剪切成含1 個冬芽的枝段，將剪好的枝段插入泡沫板中，并置于裝有自來水的塑料盒中，隨后放入光照培養(yǎng)室進行培養(yǎng)。在光照強度為2 000～3 000 lx 的燈管下培養(yǎng)12 h，黑暗培養(yǎng)12 h，溫度為25 ℃左右。每個單株做3 次重復(fù)，每個重復(fù)5 個芽。

萌芽率（%）=（萌發(fā)枝數(shù)/總扦插枝數(shù)）×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 軟件進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，用Excel、R 軟件作圖。參照張文娥等[46]的方法，采用隸屬函數(shù)法求各指標的隸屬度，并計算平均隸屬度。按照平均隸屬度將抗寒性分為5 級：0.70～1.00 為高抗（HR），0.60～0.69 為抗（R），0.40～0.59 為中抗（MR），0.30～0.39 為低抗（LR），0～0.29 為不抗（S）。

變異系數(shù)（%）=（組合F1代平均隸屬度標準差/組合F1代隸屬度的平均值）×100

超低親率（%）=（平均隸屬度低于較低親本的F1代株數(shù)/組合F1代總株數(shù)）×100

超高親率（%）=（平均隸屬度高于較高親本的F1代株數(shù)/組合F1代總株數(shù)）×100

遺傳傳遞力（%）=（組合F1代隸屬度的平均值/親本隸屬度平均值）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單株冬芽的LTE 圖

由圖1 可以看出，每個電熱模塊有6 個冬芽，基本對應(yīng)著6 個LTE 高峰。雜交后代不同單株其冬芽出現(xiàn)LTE 高峰時所對應(yīng)的溫度范圍不同，同一單株不同節(jié)位的冬芽的LTE 高峰也略有差異，但分布較為集中。

2.2 雜交后代不同指標的比較分析

由圖2 可以看出，親本及雜交后代枝條總含水量大多在47%左右，大致呈水平分布。自由水、束縛水含量及束自比、LTE 值大致呈線性分布，并且比較它們與萌芽率的關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，當枝條芽眼萌發(fā)率為100%時，枝條組織內(nèi)束縛水所占比率高，自由水所占比率低，束自比值高，LTE 值低，并且大部分都在-20 ℃以下；當萌芽率降低時，枝條組織內(nèi)自由水所占的比率變高，束縛水所占比率降低，束自比值低，LTE 值升高。這說明抗寒能力差的單株其枝條組織內(nèi)自由水所占比率高、束縛水所占比率低，束自比值低，LTE 值高。

2.3 雜交后代抗寒性的遺傳分析

親本‘北紅’和7-11-49 的平均隸屬度分別為0.58、0.42，其抗寒性等級均屬于中抗。雜交F1代出現(xiàn)了抗寒性分離，其平均隸屬度分布在0.16～0.93，雜交后代表現(xiàn)出不同程度的抗寒性，并且存在超親遺傳現(xiàn)象。其中，超過高值親本‘北紅’的有78 株，超高親率為53.8%；低于低值親本7-11-49 的有29 株，超低親率為20.0%；介于2 個親本之間的有38 株，所占比率為26.2%，變異系數(shù)為28.52%，遺傳傳遞力為116.0%。說明該雜交組合抗寒傳遞能力強，且具有抗性能力增強的傾向。

2.4 不同抗性下同一指標的比較分析

圖1 4 個單株冬芽的LTE 圖

圖2 親本及雜交后代各指標的平均值分布

圖3 不同抗性等級下同一指標的范圍值

由圖3 可以看出，雜交后代中不同抗性單株間各指標值存在顯著差異。除自由水含量這一指標外，其余幾項指標變化趨勢大體一致，隨著抗性等級遞減其各指標的絕對值在變小。高抗及抗的雜種單株枝條的總含水量顯著高于其他3 個級別，其值分布在44.0%～52.0%；不抗的顯著低于其他各個抗性等級，其值為42.6%～47.2%；中抗和低抗之間則無顯著性差異。在自由水含量方面，高抗的雜種單株枝條自由水含量顯著低于抗、中抗、低抗以及不抗的單株，其含量大致分布在14.0%～23.0%；低抗和不抗的單株自由水含量顯著高于其他抗性單株，其值為22.3%～33.0%；表現(xiàn)中抗的顯著高于表現(xiàn)抗性的單株，其值分布在19.6%～27.0%。在束縛水含量方面，高抗的顯著大于其他幾個，其值分布在27.8%～34.0%，并且隨著抗性的降低其值也在顯著地減小，表現(xiàn)不抗的最低，其值為15.4%～20.0%。束自比方面，其比值變化同束縛水含量變化一致，高抗的比值為1.2～2.2，中抗的為0.8～1.2，不抗的為0.5～0.8。從LTE 方面來看，高抗的單株冬芽LTE值顯著低于其他抗性單株，其最低值為-27.74 ℃，分布在-27.8～-23.2 ℃；不抗與低抗的無顯著差異，但顯著大于其他抗性單株，其最低值為-18.76 ℃，分布在-19.0～-15.9 ℃；中抗的LTE 值顯著大于抗性的，二者的范圍值分別為-23.0～-18.6、-25.0～-21.7 ℃。在萌芽率方面，不抗的顯著低于其他抗性單株，其值在26.0%～69.0%；低抗的顯著高于不抗的，但顯著低于高抗、抗以及中抗的，其值分布在60.0%～81.1%；高抗、抗以及中抗的單株間萌芽率無顯著性差異，且都全部萌芽。

2.5 不同指標之間的相關(guān)性分析

由圖4 可以看出，LTE 與束縛水、束自比及萌芽率之間皆具有顯著的負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.90、-0.91、-0.72；LTE 與自由水顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達0.84。自由水與束縛水、束自比之間有顯著的負相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.80、-0.93，而束縛水與束自比之間有顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.93；總含水量與自由水、萌芽率之間無顯著相關(guān)關(guān)系，與LTE、束縛水及束自比之間有顯著相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)都很低，均在0.50 以下；萌芽率與自由水、束縛水、束自比及LTE 之間皆有顯著的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.79、0.75、0.72、-0.72，相關(guān)系數(shù)均較高，所以束縛水、自由水、束自比、LTE 可以作為評價葡萄抗寒性的指標。

3 討論與結(jié)論

圖4 不同指標間的相關(guān)關(guān)系

抗性育種主要是利用高抗性的野生資源與優(yōu)質(zhì)的栽培品種雜交進行品種選育，使新品種既獲得野生資源中的重要抗性基因又能擁有栽培品種的優(yōu)良品質(zhì)[10]。為了選育出品質(zhì)優(yōu)良且抗寒性強的葡萄品種，育種家們利用高抗寒性的野生葡萄資源與品質(zhì)優(yōu)良的歐亞種進行雜交，獲得具有強抗寒性且優(yōu)質(zhì)的種間雜種?！奔t’是含有山葡萄血脈的雜交品種，其在我國北方大部分葡萄產(chǎn)區(qū)均可露地越冬[52]；7-11-49 是含有美洲葡萄（Vitis labruscaL.）和河岸葡萄（Vitis riparisMichx）血統(tǒng)的雜交品種，而美洲葡萄和河岸葡萄是抗寒性僅次于山葡萄的優(yōu)良野生資源[29,53]。2 個親本皆是抗寒性較強的品種，其雜交后代出現(xiàn)了抗寒性狀分離以及超親遺傳現(xiàn)象，且抗寒性遺傳偏向抗性增強的方向，這與柴風(fēng)梅等[10,51]的研究結(jié)果一致。

葡萄抗寒鍛煉過程中會發(fā)生一系列復(fù)雜的生理代謝活動來適應(yīng)低溫環(huán)境，而這些生理代謝活動都是在水的參與下完成的。一般而言，植物組織內(nèi)自由水所占比率越高，則植物體內(nèi)的代謝活動越強，表現(xiàn)出生長較快，但其抗逆境脅迫能力較弱，而當束縛水所占比率越高時，植物體內(nèi)的代謝活動相應(yīng)變?nèi)?，表現(xiàn)出生長慢，但其抗逆境脅迫能力卻得到增強。因此，植物組織中束縛水與自由水所占的比率能較準確地反映植物抗寒性的強弱[43-45]。本研究也發(fā)現(xiàn)，抗寒性強的單株其枝條內(nèi)束縛水含量高，自由水含量較低，束自比值高，而抗寒性弱的結(jié)果相反，這與陳佰鴻等[44]的研究結(jié)果一致。

通常，植物組織中自由水的冰點大致在0 ℃左右，束縛水卻能夠在-25～-20 ℃下保持不結(jié)冰。自由水在低溫狀態(tài)下易結(jié)冰導(dǎo)致細胞脫水死亡或者在細胞內(nèi)部形成冰晶損傷細胞膜系統(tǒng)，造成植物抗寒性下降[44-45]。因此，當植物組織中束縛水所占比率高時，植物組織的冰點就會相應(yīng)地降低，以此來提高植物的抗寒能力。本研究結(jié)果也表明，LTE 值與葡萄組織中束縛水和自由水的含量有著密切的關(guān)系。另外，用低溫放熱法來分析葡萄不同品種冬芽抗寒性強弱的過程中，應(yīng)注意在冬芽抗寒鍛煉完成或抗寒性能穩(wěn)定時取樣，保存溫度也要適宜，以免造成脫鍛煉現(xiàn)象。測定時也要注意葡萄冬芽的削取，削芽片時，既要保持芽（尤其是主芽原基）完整，又不能帶過多的節(jié)間組織，同時要做到削面平整、芽鱗完好，削后放置在有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，之后樣品準備好后立即進行LTE 檢測[34]。

另外，通過田間觀察發(fā)現(xiàn)，部分抗寒性強的單株其春季田間葡萄萌芽力低，并且有2～3 個單株的枝條出現(xiàn)干枯皺死現(xiàn)象，這可能是由于我國北方大部分地區(qū)冬季不僅嚴寒，而且干旱少雪，大氣相對濕度低，葡萄植株容易喪失水分，從而引起枝條干枯皺死。此外，冬末初春時氣溫變幅大，北京及周邊地區(qū)，大風(fēng)天氣頻繁發(fā)生，加快了枝條水分的散失，土壤解凍遲，升溫快，而根部不能及時從土壤中吸收水分來供應(yīng)樹體，致使地上部生理干旱而枯死[5,9,30,41,51,54]。因此，選育出能夠適應(yīng)我國北方冬季寒冷干旱氣候，實現(xiàn)越冬期間免埋土栽培的葡萄品種，需要其不僅抗寒性能強，而且還要有抗干旱的能力[10,51]。

本試驗利用低溫放熱法、恢復(fù)生長法以及測定自由水與束縛水，從雜交后代中選出38 株抗寒性強的單株；同時也可以看出，LTE 值、束縛水和自由水的比值與抗寒性的強弱有著密切的關(guān)系，可作為葡萄抗寒性鑒定的重要指標。