孫菲菲，曾小飚，梁敏玲，張翠嬌，邱德全，鄒 蓉

(1.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西桂林 541006；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 530000； 3.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色 533000)

0 引言

錳(Mn)是一種微量營(yíng)養(yǎng)元素，它廣泛參與植物的多種新陳代謝過(guò)程，例如葉綠素形成、光合作用以及酶活性調(diào)節(jié)等，Mn2+在這些反應(yīng)中具有不可替代的作用[1,2]。錳在土壤中的含量十分豐富，我國(guó)各地每公斤土壤中錳的平均含量約710 mg[3]。錳主要通過(guò)兩個(gè)途徑進(jìn)入土壤中：人為污染與自然污染。自然污染包括巖石風(fēng)化、火山爆發(fā)以及大氣沉降3種。人為污染途徑則有很多，包括污水灌溉、污泥使用、固體廢棄物處理不當(dāng)、礦業(yè)工業(yè)污染,以及農(nóng)藥和肥料的大量使用等[4]。據(jù)報(bào)道，全球每年有大量重金屬被人為地投進(jìn)土壤中，使土壤重金屬含量超標(biāo)，污染嚴(yán)重。錳是重金屬，在土壤中很難被降解，且會(huì)通過(guò)土壤-植物-動(dòng)物這條食物鏈在各個(gè)生物體內(nèi)富集[5]。當(dāng)植物發(fā)生錳中毒時(shí)，代表土壤中的錳含量已經(jīng)超標(biāo)[6]。植物一旦發(fā)生錳中毒，不僅產(chǎn)量減少，更為嚴(yán)重的是品質(zhì)下降，且金屬錳除了在植物體內(nèi)不斷富集外，還會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入到人體，導(dǎo)致人體體內(nèi)錳含量升高，嚴(yán)重的則會(huì)導(dǎo)致錳中毒，危害人類的生命安全。因此，研究錳脅迫下的植物生長(zhǎng)生理機(jī)制以及被重金屬污染的土壤修復(fù)具有重要意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)土壤重金屬污染問(wèn)題越來(lái)越重視，錳對(duì)植物的影響研究也紛紛展開，主要集中在生理生化角度，以及探究植物對(duì)錳脅迫的響應(yīng)機(jī)制[7]。李欣航等[8]研究不同濃度錳脅迫對(duì)雞眼草(Kummerowiastriata)種子發(fā)芽、幼苗生長(zhǎng)及幼苗生理生化特性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著錳濃度的升高，雞眼草種子的發(fā)芽率呈逐漸降低趨勢(shì)，幼苗生長(zhǎng)則呈現(xiàn)“低促高抑”現(xiàn)象。曹婧等[9]研究發(fā)現(xiàn)，隨著Mn2+脅迫程度增大，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)的株高生長(zhǎng)速率、地上和地下生物量先升高后下降，苜蓿粗蛋白質(zhì)含量在10 mg/L Mn2+處理下最高，而丙二醛(MDA)含量則呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。楊紅蘭等[10]研究不同Mn2+濃度脅迫下降香黃檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)生長(zhǎng)和生理特性的變化，發(fā)現(xiàn)隨著Mn2+濃度的增加，降香黃檀植物體中的丙二醛(MDA)含量、過(guò)氧化物酶(POD)活性和活性糖含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。

向日葵(HelianthusannuusL.)是菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus)一年生草本植物，高1-3 m;有較大的頭狀花序，花序直徑10-30 cm;瘦果倒卵形或長(zhǎng)圓形;花期7-9月，果期8-9月[11]。向日葵的根系較為發(fā)達(dá)，抗旱耐貧瘠，而且生長(zhǎng)周期短，對(duì)重金屬的吸收較好，可以較為理想地修復(fù)土壤，因此，向日葵具有較顯著的環(huán)境污染治理潛力，值得深入研究[12-14]。本實(shí)驗(yàn)擬探究在不同濃度錳脅迫下，向日葵生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，及其對(duì)錳污染的生理生化響應(yīng)機(jī)制，以期為土壤重金屬污染治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用苗

向日葵幼苗(種子購(gòu)自百色市種子商店，通過(guò)沙培盆栽法培育成幼苗)。

1.1.2 器材

LRH-150-S恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；制冰機(jī)；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；QT-2漩渦混合儀，上海琪特分析儀器有限公司；研缽、15 mL和1 000 mL容量瓶、移液槍、玻璃棒、燒杯、721型分光光度計(jì)等。

1.1.3 試劑

氯化錳、硫代巴吡妥酸(TBA)、磺基水楊酸、石英砂、冰乙酸、甲苯、考馬斯亮藍(lán)G250、丙酮、碳酸鈣、磷酸、三氯乙酸(TCA)、過(guò)氧化氫酶。以上試劑皆為分析純(AR)。

1.2 方法

1.2.1 幼苗的脅迫處理

向日葵種子培養(yǎng)萌發(fā)出芽后，精準(zhǔn)稱量氯化錳，用去離子水配制成0，20，50，100，200，300 mg/L的6種濃度的Mn2+脅迫液處理幼苗(其中0 mg/L為空白對(duì)照組)：挑選生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗24棵，分為6組并編號(hào)，每組4棵向日葵幼苗并用對(duì)應(yīng)的脅迫液澆灌，脅迫一周后剪取向日葵幼苗葉片進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，即丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)、游離脯氨酸(Pro)、葉綠素、蛋白質(zhì)(Pr)含量的測(cè)定。

1.2.2 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

MDA、SS的含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[15]；蛋白質(zhì)(Pr)的含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[16]；葉綠素的含量測(cè)定采用分光光度計(jì)法[17]；Pro含量測(cè)定采用酸性茚三酮法[18]。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)均是4次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 錳脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片中丙二醛(MDA)含量的影響

不同濃度錳脅迫下，向日葵幼苗葉片MDA含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出，隨著Mn2+濃度的增高，向日葵幼苗葉片中MDA含量呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)：開始時(shí)，MDA含量增加不太明顯，當(dāng)Mn2+濃度超過(guò)20 mg/L時(shí)，MDA含量上升速度加快，當(dāng)Mn2+濃度為20，50，100，200，300 mg/L時(shí)分別比對(duì)照組上升了2%、11%、30%、44%、57%。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)重金屬錳的濃度大于100 mg/L時(shí)，MDA含量的增長(zhǎng)速度逐漸減緩。

2.2 錳脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片中蛋白質(zhì)(Pr)含量的影響

不同濃度錳脅迫下，向日葵幼苗葉片Pr含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，隨著Mn2+濃度的不斷升高，向日葵幼苗葉片中Pr含量呈現(xiàn)先升高達(dá)到峰值后再下降的趨勢(shì)：當(dāng)Mn2+濃度從20 mg/L升高到200 mg/L，向日葵中Pr含量呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)，其中Mn2+濃度為20，50，100，200 mg/L時(shí)分別是對(duì)照組的1.04，1.07，1.14，1.17倍；當(dāng)Mn2+濃度從200 mg/L到300 mg/L，向日葵中Pr含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中Mn2+濃度為300 mg/L時(shí)，向日葵幼苗葉片中Pr含量是對(duì)照組的89%，明顯降低。

圖1 不同濃度Mn2+脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片丙二醛(MDA)含量的影響

圖2 不同濃度Mn2+脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片蛋白質(zhì)(Pr)含量的影響

2.3 錳脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片葉綠素含量的影響

不同濃度錳脅迫下，向日葵幼苗葉片中葉綠素含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。如圖3所示，隨著錳脅迫濃度的不斷升高，向日葵幼苗葉片的總?cè)~綠素含量呈現(xiàn)先升高達(dá)到峰值后開始下降的趨勢(shì)：Mn2+濃度在20-100 mg/L時(shí)，總?cè)~綠素含量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)Mn2+濃度在100-300 mg/L時(shí)，向日葵幼苗葉片中總?cè)~綠素的含量逐漸下降。Mn2+濃度為20，50，100，200，300 mg/L時(shí)，分別是對(duì)照組的1.33，1.47，1.58，1.49，1.41倍。葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素升降趨勢(shì)基本一致，都在Mn2+濃度為100 mg/L時(shí)達(dá)到峰值。

圖3 不同濃度Mn2+脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片中總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量的影響

2.4 錳脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片游離脯氨酸(Pro)含量的影響

不同濃度錳脅迫下，向日葵幼苗葉片Pro含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，隨著Mn2+濃度不斷升高，向日葵幼苗葉片Pro含量呈現(xiàn)一直上升的趨勢(shì)，而且當(dāng)Mn2+濃度小于100 mg/L時(shí)，Pro含量變化趨勢(shì)不明顯。Mn2+濃度為20，50，100，200，300 mg/L時(shí)，向日葵幼苗葉片Pro含量分別是對(duì)照組的1.76，1.82，2.10，3.72，5.74倍。當(dāng)Mn2+濃度超過(guò)100 mg/L時(shí)，向日葵幼苗葉片Pro含量開始急劇上升。

圖4 不同濃度Mn2+脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片游離脯氨酸(Pro)含量的影響

2.5 錳脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片可溶性糖(SS)含量的影響

不同濃度錳脅迫下，向日葵幼苗葉片SS含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，隨著Mn2+濃度不斷升高，向日葵幼苗葉片SS含量呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)，且在低濃度時(shí)，可溶性糖含量增加趨勢(shì)是緩慢的。Mn2+濃度為20，50，100，200，300 mg/L時(shí)，向日葵幼苗葉片SS含量分別比對(duì)照組增加了3%、8%、19%、23%、26%。

圖5 不同濃度Mn2+脅迫對(duì)向日葵幼苗葉片可溶性糖(SS)含量的影響

3 討論

3.1 錳脅迫對(duì)向日葵幼苗抗氧化活性的影響

當(dāng)植物不適合在某地生長(zhǎng)時(shí)，其體內(nèi)會(huì)聚集大量有毒有害物質(zhì)(例如自由基、活性氧等)時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致其生理代謝紊亂[19]。植物在不適宜的環(huán)境中生長(zhǎng)，會(huì)生成大量的活性氧(ROS)，而這些活性氧會(huì)長(zhǎng)期存在細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞膜接觸發(fā)生反應(yīng)，MDA就是膜脂過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，而Pro在植物體內(nèi)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的作用，并參與調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)[20]，可溶性糖則是作為調(diào)節(jié)滲透壓的一種物質(zhì)。當(dāng)植物受到錳脅迫時(shí)，活性氧等物質(zhì)在體內(nèi)不斷積累，使其體內(nèi)的膜脂發(fā)生氧化反應(yīng)或者脫脂，生成大量的丙二醛、脯氨酸以及可溶性糖，所以MDA、Pro及可溶性糖的增加可以看作是脅迫條件下植物體本身的一種響應(yīng)機(jī)制，起到保護(hù)植物體本身的作用[21]。曹婧等[9]發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿中MDA是隨著錳脅迫濃度的增加而不斷上升，與本研究結(jié)果一致。黃開騰等[22]研究發(fā)現(xiàn)隨著鋁錳復(fù)合脅迫濃度的增加，向日葵幼苗葉片的Pro含量總體呈上升趨勢(shì)，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)植物在逆環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)，這些指標(biāo)均會(huì)升高，它們與植物的抗氧化活性息息相關(guān)[23]。

3.2 錳脅迫對(duì)向日葵幼苗光合作用的影響

植物體內(nèi)的葉綠素含量會(huì)直接影響植物光合作用的強(qiáng)弱，從而影響植物的正常生長(zhǎng)代謝[24]。葉綠素的合成與蛋白質(zhì)的合成之間相互影響：蛋白質(zhì)合成受抑制導(dǎo)致葉綠素合成缺少所需的酶，阻礙了向日葵幼苗對(duì)鐵(Fe)和鎂(Mg)的吸收;而葉綠素合成受抑制將導(dǎo)致光合作用減弱，蛋白質(zhì)合成受到影響。可見(jiàn)，光合作用受到多方面的影響，是葉綠素和蛋白質(zhì)共同作用的結(jié)果。低濃度Mn2+可以促進(jìn)向日葵幼苗體內(nèi)總?cè)~綠素、葉綠素a、b含量生成，以及蛋白質(zhì)含量的增加，從而促進(jìn)向日葵幼苗的生長(zhǎng)；但當(dāng)Mn2+濃度超過(guò)100 mg/L時(shí)，向日葵體內(nèi)總?cè)~綠素、葉綠素a、b含量生成，以及蛋白質(zhì)含量開始降低，光合作用受到抑制。

4 結(jié)論

向日葵幼苗葉片中丙二醛(MDA)、游離脯氨酸(Pro)以及可溶性糖(SS)的含量都隨著錳脅迫濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。而向日葵幼苗葉片葉綠素和蛋白質(zhì)(Pr)的含量則呈現(xiàn)出隨著脅迫濃度升高而先升高再下降的趨勢(shì)：在Mn2+濃度為100 mmol/L時(shí)，向日葵幼苗葉片的總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b含量達(dá)到峰值，之后隨著Mn2+濃度的繼續(xù)增加而顯著下降；在Mn2+濃度為200 mmol/L時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高，而后急劇下降。綜上可見(jiàn)，低濃度的Mn2+對(duì)向日葵植株有顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，細(xì)胞代謝加快；高濃度Mn2+對(duì)向日葵植株有顯著的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，甚至植株死亡。向日葵可以種植在被重金屬低濃度污染的土壤中，一方面可以加快土壤凈化，另一方面可以促進(jìn)植株的生長(zhǎng)發(fā)育。