張瑋川，李劍，王志宇，楊航，劉慶輝，李艷，嚴文浩

（南昌航空大學重金屬污染物控制與資源化國家地方聯(lián)合工程研究中心，南昌 330063）

從20 世紀開始，世界人口數量不斷增多，人們的生活和生產活動也隨之變化，這使得自然資源和環(huán)境資源都面臨巨大的威脅。在人們生活生產活動中，許多有毒有害的污染物被排放到了自然環(huán)境中，其中包括重金屬、持久性有機污染物、揮發(fā)性有機物、有機農藥等。這些污染物對自然生態(tài)造成了十分嚴重的破壞，所以對于污染物修復和治理方法的研究日益受到關注。在眾多污染物修復方法中，生物修復法因修復效果好、修復成本較低，且不會產生二次污染，被廣泛應用。

然而，單獨的植物修復或者微生物修復方法存在很多不足之處，比如修復效率低、專一性強、只能適用中低濃度污染等。而植物-微生物聯(lián)合修復是一種更加有效的修復方式，它成功彌補了這些缺陷。微生物和植物聯(lián)合修復不僅能使植物對污染物的耐受程度大大增加，而且還能夠促進植物根系吸收土壤中營養(yǎng)物質，提高植株生物量，并且微生物可以協(xié)同植物從土壤中向地上部分轉移污染物，并在植物體內富集、轉化和利用，從而有效完成對環(huán)境污染的修復[1]。因此，利用植物-微生物聯(lián)合修復體系，尤其是內生菌聯(lián)合植物修復體系修復污染土壤的研究越來越受到關注。

內生菌（Endophyte）是指定殖在植物表皮細胞層間隙或組織器官內部，并與植物形成互利共生或無病害寄生的一類微生物[2]。越來越多的研究者發(fā)現從植物的組織內部可以分離出微生物，故將這些微生物命名為內生菌，并且開始關注內生菌與植物之間的相互作用關系。

在長期的相互作用下，內生菌與宿主植物之間結成了穩(wěn)定的共生關系。研究報道，內生菌能產生促生物質來促進宿主植物的生長，還能進行生物固氮和溶磷來幫助宿主植物吸收氮磷，而且內生菌還可以增強宿主植物對生長環(huán)境中污染物的抗性[3-6]。本研究主要歸納了近幾年植物接種內生菌的方法，分析內生菌在植物體內的定殖動態(tài)特征，以及內生菌-植物聯(lián)合修復污染土壤的作用機理和應用前景，并且對今后的研究方向進行了展望，為內生菌-植物聯(lián)合修復污染土壤研究和應用提供一定的理論依據。

1 內生菌接種植物的方法

接種內生菌的方法主要是通過模擬自然環(huán)境中內生菌從植物的自然孔口或者傷口入侵到植物組織內部的方法。如圖1 所示，人工接種具體來說就是利用植物的自然孔口或者人為制造的切口，使得內生菌可以通過這些空隙進入到植物組織內部，從而在植物體內定殖。對于通過植物自然孔口接種來說，根部接種內生菌的主要途徑是根系與土壤等摩擦造成的傷口，而莖部接種則是將莖干上的皮孔、蜜腺等作為侵入通道，葉部侵入則是將氣孔、水孔等作為侵染通道進入到植物內部[7]。

圖1 內生菌接種植物的方法Figure 1 Method of inoculating endophytes to host plants

從表1 可以看出，人工接種植物內生菌有多種方法，灌根法、浸根法、傷根法、蘸根法等方法是對植物根部進行接種；傷莖法、涂莖法是對植物莖部進行接種；噴霧法、傷葉法等則是對植物葉部的接種方法；另外也可在種子階段使用浸種法。但目前大多數研究主要集中在對植物根部的接種，這可能是由于植物所需營養(yǎng)物質主要是通過根部吸收，當土壤中內生菌在植物根部吸收營養(yǎng)物質時更容易侵染到植物內部[7]。

2 內生菌在植物體內的定殖

2.1 植物內生菌定殖的檢測方法

因為宿主植物生長在不同的生存環(huán)境中，內生菌與宿主植物之間的作用難以分析，所以目前對于內生菌在植物內部的生命活動的認識不夠明晰，而對目標內生菌在宿主植物體內進行定殖檢測是解決這一問題的重要手段，要對內生菌在宿主植物組織內部的定殖動態(tài)進行追蹤，就需要采用合適的檢測方法，對其進行系統(tǒng)性研究，并探討內生菌在宿主植物體內的定殖規(guī)律、內生現象和內生機制。

目前，對目標內生菌在宿主植物體內的定殖檢測有很多方法（表1），其中抗生素標記法是一種常用的定殖檢測方法，主要是通過人工誘變等手段作用于目標內生菌，使目標菌出現具有抗高濃度抗生素的突變體，再將突變體篩選純化出來作為標記菌株，用含高濃度抗生素的培養(yǎng)基進行回收檢測。研究中主要使用利福平、鏈霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、卡那霉素等抗生素作為抗性標記[21]。大多數研究中的抗生素標記法采用利福平作為抗性標記，因為其生物防治性狀較易保存?？股貥擞浄ǖ膬?yōu)勢在于簡單、高效、成本低，并且能夠對檢測結果進行統(tǒng)計分析；但劣勢在于不夠準確、回收下限較高。姚錦愛等[13]運用抗生素標記法使得菌株BA-3-K（Bacillus amyloliquefaciens）獲得對利福平和卡那霉素的穩(wěn)定抗性，從而研究其在蘭花中的定殖動態(tài)。Glandorf等[15]通過免疫檢測驗證了對利福平的抗性可以作為菌株WCS358（Pseudomonas putida）的穩(wěn)定標記性狀。

表1 內生菌的接種及其宿主植物Table 1 The inoculation of endophytes and their host plants

除此之外，還有外源基因標記法，其中熒光蛋白標記（Fluorescent protein labeling）是被廣泛采用的一種外源基因標記法，這種方法是將不同顏色的熒光質粒結合到其他生物中，使目標生物攜帶顏色熒光，并且不影響該生物的正常生命活動[22]。熒光蛋白標記不需要生物具備其他輔助系統(tǒng)，發(fā)出的熒光可以使標記菌株能夠更容易被看見，從而更加方便進行追蹤檢測。熒光蛋白標記主要有兩種轉化方法，分別是熱激轉導和電擊轉化，且很多研究者致力于熒光蛋白質粒導入細菌的技術研究，使得這項技術不斷發(fā)展[23]。對于生物來說，熒光蛋白在保持熒光時不會干擾其正常生命活動，因此熒光蛋白在生物研究過程中被許多研究者采用[24-25]。

近年來，隨著人們對綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）結構和功能認識的逐步深入，GFP 編碼的基因已經成為最具有應用前景的標記物[26-27]。GFP 基因來源于水母[28]，表達綠色熒光蛋白。綠色熒光蛋白標記的優(yōu)勢在于對標記目標進行檢測時可以直接進行活體觀察，檢測靈敏度高，且被標記目標無需加入其他引物就能夠穩(wěn)定發(fā)出綠色熒光。綠色熒光蛋白可用以檢測在宿主植物體內標記菌株的實時生命活動，從而更加精確地進行目標內生菌的跟蹤研究，與其他外源基因標記相比具有明顯的優(yōu)勢[29]。但熒光蛋白標記也有許多問題亟待解決，例如對目標基因轉導不成功或者熒光顏色較暗，而且引入外源基因會使細胞正常代謝過程受到影響，使得標記目標的生物學效益降低，同時會因為被標記的細胞死亡后不再發(fā)出熒光而無法檢測[18,30]。

2.2 植物內生菌的定殖動態(tài)

內生菌在宿主植物體內的定殖是一個空間上和時間上的動態(tài)過程。遲峰[16]研究了根瘤菌在水稻體內的定殖過程，結果表明根瘤菌先定殖在水稻根際表面，接種6 d 后從根部裂隙進入內部，在10～14 d 擴散到相鄰組織，21 d 后開始向地上部分遷移。李強等[31]檢測侵染小麥幼苗根部的莖瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）的定殖動態(tài)，結果顯示該菌先通過根尖破損處定殖在根部組織細胞間隙和細胞內，隨后向上遷移定殖到葉片部位。這些研究都說明了內生菌會在宿主植物組織間移動，是一個在空間上的動態(tài)定殖。不僅如此，內生菌在植物體內的定殖同樣也是一個時間上的動態(tài)過程，內生菌在宿主植物內的定殖菌量會隨著時間變化發(fā)生動態(tài)變化。Bisht 等[10]在美洲黑楊的根部接種內生菌SBER3（Bacillussp.）后對其定殖菌量進行測定，結果表明這個內生菌的定殖菌量隨時間延長而穩(wěn)定增加。劉文韜等[11]研究表明，在芘污染環(huán)境下，功能內生菌株Enterobactersp.PRd5在小麥和空心菜組織內部的定殖量相較于無污染對照組有顯著增加。這說明面對外部污染物的脅迫，對污染物具有抗性或者降解功能的內生菌可以更好地在宿主植物體內定殖。雖然有很多研究已經發(fā)現了內生菌在植物體內定殖的部分規(guī)律，但宿主植物的種類和生長環(huán)境，以及內生菌的種類和接種方式，都會影響內生菌在宿主植物各組織器官間的遷移運動和某一時間段定殖菌數量的動態(tài)過程。這給系統(tǒng)總結內生菌在宿主植物體內的定殖動態(tài)規(guī)律帶來了很大困難。

3 內生菌聯(lián)合植物修復土壤的應用

3.1 對土壤重金屬的修復

單一的植物或微生物修復土壤重金屬污染的效果不佳，而內生菌聯(lián)合植物修復體系能夠有效提升修復土壤重金屬污染的能力。萬勇[32-33]從鎘的超富集植物龍葵中分離篩選出了內生菌DE5（Variovorax paradoxu），經實驗測試能夠耐受Cd 濃度為200 mg·L-1，與未接種的空白對照組相比，接種了DE5的青葙根部生物量增加了125.0%，其對Cd 的富集能力增強了81%。Li 等[34]將內生細菌K3-2（Enterobactersp.）定殖到蘇丹草中能夠有效增加植物的生物量和植物體內Cu2+的積累量，與未接種內生菌的對照組相比，接種了內生菌的植物對Cu2+的吸收量從49%提升至95%。Babu 等[35]從樟子松的根中分離得到GSB-1 菌株（Bacillus thuringiensis），該菌株可以產生促進植物生長的因子，并提升去除潛在有毒金屬的效果，將GSB-1 植入宿主植物體內后，植物幼苗中的葉綠素含量、生物量，以及Cu、As、Ni、Zn 和Pb 等重金提取效果都有所增加。

3.2 對土壤有機污染物的修復

隨著研究者們對于植物與微生物聯(lián)合修復的不斷探索，已經發(fā)現有多個菌屬能和宿主植物建立良好的相互作用關系，其中芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）和不動桿菌屬（Acinetobactersp.）等具有降解柴油[36-37]、苯酚[38]、芘[39]等有機污染物的能力。大多數從植物內分離出的內生菌都具有促進植物生長的特點，并且內生菌聯(lián)合植物修復所表現出的修復潛力相較于單獨運用內生菌或植物修復更加具有優(yōu)勢[40-41]。Germaine 等[42]構建了一種萘降解內生菌株假單胞菌VM1441（Pseudomonas putida），這種菌株可以有效定殖在植物根際和根部組織內部，幫助宿主植物抵抗萘的侵害，在含有萘的環(huán)境中與未接種植物相比，接種后的植物種子發(fā)芽率和植物蒸騰率都有所提高，并且有效降解了環(huán)境中的萘。Khan等[43]研究發(fā)現假單胞菌屬PD1（Pseudomonas putida）接種到柳樹和草中均可以促進宿主植物的生長，將接種植株和未接種植株栽種到含菲土壤中，接種植株對菲的去除效率提升了25%～40%。田林雙[44]將擬內生菌莖點霉菌B3（Phomopsis liquidambari）定殖到水稻中，與未接種植株一起放置到菲的環(huán)境中，發(fā)現接種植株可以在菲環(huán)境中更好生長，并且接種菌株還能增強水稻中菲的降解效果。這些研究表明接種具有降解有機物功能的內生菌可以有效強化植物對土壤有機物污染的修復能力，為修復土壤有機物污染的方法提供了重要參考。

4 內生菌聯(lián)合植物修復的機理

如圖2 所示，內生菌聯(lián)合植物修復的機理主要包括兩部分：一方面，植物可以為內生菌提供適宜的生長環(huán)境和生命活動所需的營養(yǎng)物質，使得內生菌生物量增加；另一方面，內生菌能夠通過調節(jié)生長因子、生物固氮和溶磷等方式促進宿主植物生長，并且內生菌可降解污染物或者降低其毒性，從而提升宿主植物的污染修復能力，使得土壤中污染物向地上部分轉運。

圖2 內生菌聯(lián)合植物修復機理Figure 2 Mechanism of endophyte-assisted phytoremediation

4.1 內生菌對植物的促生機制

許多研究者對內生菌促進植物生長的機制進行了探索。內生菌對宿主植物的生長有一定的促進作用，相較于沒有接種內生菌的植物而言，接種內生菌的植株生長情況較好，具體體現在種子發(fā)芽、幼苗存活、植株高度、植株干質量和生物量積累等多方面[32-33,43-44]。

4.1.1 調節(jié)植物生長

內生菌能夠促進宿主植物光合作用，從而促進植物生長。Mirzahossini 等[45]將接種了內生菌Epichloe coenophiala的高羊茅（Festuca arundinacea）放置在含高濃度Ni 的環(huán)境中，與未接種內生菌的對照組相比，接種內生菌植株體內的葉綠素含量有很大的提升。內生菌還能夠分泌一些促進植物生長發(fā)育的生長調節(jié)劑，例如吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、細胞分裂素（Cytokinin，CTK）、赤霉素（Gibberrellin acid，GA）等，這些生長調節(jié)劑可以在促進植物生長的同時有效緩解環(huán)境污染物對植物的毒害作用[46]。內生菌還可以加強植物的蒸騰作用，提升水分利用效率，從而促進宿主植物的生長，提高在缺水環(huán)境下的存活率[47]。

4.1.2 生物固氮和溶磷

植物的正常生命代謝活動需要氮元素來維持，但是氮元素大多以氮氣的形式存在，不能被植物直接利用，所以需要通過生物固氮給植物提供氮元素。生物固氮是將氮氣通過微生物的作用，轉變成可以讓植物吸收的銨根離子，用以維持植物的正常生長[48]。諸如F.tricinctum、A.alternata、Epichlo? coenophiala等內生菌能夠分泌一些特定的酶，這些酶對于植物吸收氮元素的過程有一定的調控作用，將這些內生菌定殖到植物體內可以促進植物對氮元素的吸收，并且使得宿主植物的根系得到強化[49-50]。

磷也是維持植物生命活動的重要元素之一，但是自然環(huán)境中大部分的磷元素以難溶無機復合物的形式存在，植物無法直接吸收，而部分內生菌可以將這些難溶的復合物通過酸化、螯合或者離子交換作用轉換成能夠被植物利用的磷元素，例如Piriformospora indica和Pseudomonassp.[51-52]。

4.1.3 分泌鐵載體

鐵元素是植物生長不可或缺的元素,植物缺少鐵元素會導致葉片黃化。雖然鐵元素在地殼中的含量很高，但是大部分鐵以氧化態(tài)或氫氧化態(tài)的形式存在，溶解度極低[53]。鐵載體是對三價鐵離子（Fe3+）和二價鐵離子（Fe2+）具有高度親和力的蛋白質，能與重金屬離子結合形成螯合物，部分內生菌可以分泌鐵載體，結合宿主植物所需要的金屬離子，向植物提供促進生長所需的金屬元素[54]。Chen 等[55]從龍葵（Solanum nigrumL.）中分離出的內生菌產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）可以分泌鐵載體，并有效促進植物生長，提高植物修復土壤中Cd污染的能力。

4.2 內生菌強化植物修復重金屬污染物的機制

4.2.1 提高植物對重金屬的抗性

在重金屬脅迫下，內生菌通常比植物更加耐受多種重金屬污染，在內生菌與宿主植物相互作用下，宿主植物對重金屬的抗性進一步增強。內生菌能夠提升宿主植物對污染環(huán)境的適應能力，并加強其對污染環(huán)境的修復效果[56-57]。重金屬脅迫下的植物會在體內積累大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），這嚴重影響到植物的正常生命活動，對植物細胞膜的完整性、植物內酶的活性、植物細胞器功能等造成很大的損害[58-60]。研究表明植物體內的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）等抗氧化酶能有效減輕重金屬對植物的危害[61]。Hamilton 等[62]則發(fā)現接種內生菌能夠有效提高宿主植物內抗氧化酶的活性，進而提升宿主植物對重金屬的抗性。

4.2.2 改變重金屬的生物有效性

內生菌可以產生許多能夠與重金屬結合、改變重金屬生物有效性的物質，例如鐵載體、有機酸和表面活性劑等，這些物質能夠有效減輕重金屬對宿主植物的脅迫[54]。Pan 等[63]從東南景天中分離出內生菌熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），通過實驗驗證這種菌能夠分泌鐵載體，將其接種到含Cd污染的（甘藍型）油菜（Brassica napus）后，與未接種植株相比，宿主植物對Cd2+的吸收能力顯著提高，說明鐵載體能夠結合植物體內的重金屬，強化植物對重金屬的吸收。Ma 等[64]將內生菌E6S（Achromobacter piechaudii）接種到伴礦景天（Sedum plumbizincicola）之中，發(fā)現其在植物體內會產生有機酸及可溶性磷酸鹽，可以提高土壤中Cd、Zn、Pb 的生物可利用性，進而提升宿主植物對土壤中這些重金屬的吸收能力。Long 等[65]從東南景天中分離出了多種具有Zn 和Cd 抗性的內生菌，并且發(fā)現銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）能夠分泌一種脂化合物的表面活性劑，可以提高對重金屬Zn的溶解能力和東南景天對土壤中重金屬Zn的提取效率。

4.3 內生菌強化植物修復有機污染物的機制

4.3.1 內生菌在植物體內的共代謝

大多數有機化合物的分子結構復雜，對生物有毒害作用，所以很難被微生物用作直接碳源，并且一些有機物還會對微生物的生長繁殖有抑制作用。但是，研究發(fā)現內生菌可能會通過共代謝降解植物體內存在的有機污染物[66-67]。研究者們針對內生菌在植物體內的共代謝提出了兩種可能。Stumpe 等[68]認為植物通過光合作用合成糖類、有機酸和氨基酸等生長物質，這些物質為內生菌提供了碳源和能源，并且可以促進內生菌產生誘導酶將有機污染物降解，使得植物體內有機物的降解效果增強。Subramanyam 等[69]則認為植物會產生諸如黃酮類化合物、水楊酸和木質素衍生物等代謝產物，這些產物可以被內生菌當作初級底物所利用，而且這些物質與許多有機污染物具有相似的結構，甚至是一些有機物污染降解的中間產物或誘導劑，所以會刺激內生菌產生能夠降解有機污染物的活性酶，從而提升有機物的降解效果。

4.3.2 內生菌產生特定酶對有機污染物進行逐步降解

內生菌可以分泌出多種具有特異性的酶，這些酶對有機污染物的降解具有促進作用。Ning 等[70]將黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）置于含菲的環(huán)境中，可以從內生菌中分離得到細胞色素P450和錳過氧化物酶，通過實驗驗證了提高錳過氧化物酶的活性可以有效提升菲的降解效果。Corrêa 等[71]發(fā)現內生菌具有獨特的木質素氧化系統(tǒng)，可以分泌出漆酶、木質素酶和過氧化物酶等特異性酶，對有機污染物進行高效降解。Ambrose等[72]研究表明內生菌定殖在植物體內后可以產生水楊酸羥化酶，對植物體內的水楊酸進行降解，提升內生菌在宿主植物內部的穩(wěn)定性，并且還能夠產生其他特異性酶對植物體內的有機污染物進行降解。劉世亮等[73]推測一些能降解多環(huán)芳烴的微生物會產生加氧酶，可以在多環(huán)芳烴的苯環(huán)內加入氧原子使環(huán)斷裂，從而達到降解多環(huán)芳烴的效果。不同的底物會誘導內生菌產生相應的酶，這些酶可以將難降解的有機污染物轉化成更容易降解的物質，并且這些轉化后的物質還可以當作內生菌的碳源，用來進行生命活動，從而更加高效地降解有機污染物[74]。

5 結論與展望

內生菌聯(lián)合植物修復體系因其降解效率高、修復徹底等優(yōu)點在環(huán)境污染修復領域受到了越來越多的關注，也取得了很多研究成果。內生菌聯(lián)合植物降解污染物受到土壤質地、土壤養(yǎng)分、溫度、降水等難以控制的環(huán)境條件的影響較大，在自然環(huán)境中應用此方法仍存在難點。

（1）受植物生長環(huán)境等因素的影響，依然無法完全解釋在內生菌聯(lián)合植物修復體系中，內生菌和植物之間通過相互作用來降解污染物的機理。比如內生菌在宿主植物定殖后的轉移規(guī)律和持久性，以及植物代謝產物對內生菌處理污染物的影響。

（2）污染物的降解通常是由多種內生菌共同作用，而目前大多數研究只針對單一內生菌聯(lián)合植物修復，對于多種內生菌組合在宿主植物內相互作用、聯(lián)合代謝及其在植物內部的分布還鮮有報道。

（3）就應用范圍來看，目前大多數微生物聯(lián)合植物修復體系主要針對土壤污染，其對空氣和水體污染的修復同樣具有很大潛力，亟待加強研究。

因此，對于內生菌聯(lián)合植物修復污染的研究可以從以下幾個方面深入：

（1）將內生菌在植物體內的定殖規(guī)律與處理污染物的能力相關聯(lián)，研究內生菌的定殖對于植物處理污染能力的影響。

（2）應用內生菌-植物聯(lián)合修復技術處理空氣中的污染物。

（3）開展多種內生菌與植物聯(lián)合體系在自然環(huán)境中相互作用的模擬研究，探究多種不同的內生菌與植物的聯(lián)合修復體系，從而為實際應用提供指導。