楊偉克，唐芬芬，楊 海

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2.紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 蒙自 661101)

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP，EC 3.1.3.1)是一類高度保守的磷酸水解酶，直接參與生物體磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝過(guò)程[1]。ALP主要分布在昆蟲的腸道、血淋巴、脂肪體和唾液腺等部位，它不僅參與機(jī)體的能量代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、激素合成等過(guò)程，而且在昆蟲機(jī)體的解毒代謝和免疫防御過(guò)程也發(fā)揮著重要功能[2]。ALP對(duì)于家蠶機(jī)體生理代謝的穩(wěn)定性極其重要，其活性大小與蠶體的生理狀態(tài)及抗病性密切相關(guān)[3-4]。通常情況下，ALP活性越高，蠶體抗性越強(qiáng)，其幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育健康齊一，繭絲產(chǎn)量和質(zhì)量在一定程度上均有所提高[5]。

家蠶來(lái)源于野桑蠶，由于長(zhǎng)期人為的馴化，其對(duì)野外環(huán)境、氣候及農(nóng)藥等的適應(yīng)性相對(duì)較弱。有機(jī)磷農(nóng)藥是桑園常用的一類殺蟲劑，它在一定程度上能有效防治桑園害蟲，但對(duì)以桑葉為唯一食物來(lái)源的家蠶也會(huì)造成一定的毒害作用[6]。昆蟲在遭受有機(jī)磷農(nóng)藥脅迫時(shí)，機(jī)體正常生理代謝平衡被打破，解毒酶、抗氧化酶以及各種水解酶等一系列酶均會(huì)發(fā)生不同程度的變化[7-8]。ALP被認(rèn)為是一類與昆蟲抗性密切相關(guān)的水解酶，它不僅參與昆蟲抵御病原微生物的侵染過(guò)程，而且在殺蟲劑的解毒代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[9]。高建華等[10]用BmNPV感染家蠶幼蟲，發(fā)現(xiàn)ALP活性及其編碼基因的表達(dá)量在感染中期增加，在感染后期會(huì)急劇減弱，表明ALP參與了家蠶抗BmNPV的免疫防御過(guò)程。家蠶遭受蘇云金芽孢桿菌或黑胸?cái)⊙挎邨U菌感染后，機(jī)體ALP活性呈現(xiàn)先逐漸增強(qiáng)后急劇減弱的的變化趨勢(shì)[11-12]。孫毅等[13]用家蠶病原微孢子蟲N.b和SCM6交叉感染四齡家蠶，中腸ALP活性呈現(xiàn)先迅速升高隨后急劇降低的趨勢(shì)。用HearNPV侵染棉鈴蟲幼蟲，能夠顯著抑制ALP的活性，且抑制作用與感染病毒的劑量和感染后時(shí)間的增加呈正相關(guān)。ALP活性的下降與病毒下調(diào)其編碼基因ALP的表達(dá)水平有關(guān)[14]。用低劑量的螟硫磷處理云杉色卷蛾，其血淋巴和中腸ALP基因被顯著上調(diào)，編碼的堿性磷酸酶活性也顯著高于對(duì)照組[15]。氟對(duì)家蠶中腸和血淋巴ALP活性有明顯的抑制作用，該抑制作用會(huì)隨著氟濃度的增加而增強(qiáng)，中腸ALP活性降低會(huì)導(dǎo)致家蠶幼蟲體質(zhì)量顯著降低[16]。

辛硫磷作為一種高效低毒的有機(jī)磷殺蟲劑，具有廣譜性和高效性，被廣泛應(yīng)用于桑園害蟲的防治[17]。乙酰膽堿酯酶、細(xì)胞色素P450氧化酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和酯酶等參與家蠶有機(jī)磷農(nóng)藥和殺蟲劑代謝的研究已有大量報(bào)道[18-20]，而關(guān)于ALP在家蠶代謝有機(jī)磷農(nóng)藥過(guò)程中的生理作用及分子機(jī)制的研究鮮見報(bào)道。以家蠶ALP為靶標(biāo)，研究喂食辛硫磷后家蠶不同組織ALP活性變化規(guī)律，明確ALP在家蠶對(duì)辛硫磷代謝過(guò)程中發(fā)揮的功能和作用，旨在為解析家蠶等鱗翅目昆蟲對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的解毒代謝機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試家蠶品種為大造，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所資源研究室保存和飼育。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 Thermo Fisher雙光束紫外/可見分光光度計(jì)和ThermoFisher高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自昆明伯騰儀器有限公司，HSW24型電熱恒溫水浴鍋和IMS-40雪花制冰機(jī)購(gòu)自廣州深華生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 主要試劑 辛硫磷購(gòu)自江蘇寶靈化工股份有限公司，丙酮、對(duì)硝基苯磷酸二鈉、巴比妥鈉鹽酸緩沖液和氫氧化鈉等試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 添毒方法 將辛硫磷原藥溶于丙酮配制成100 g/L的原液，再用水稀釋成1 g/L的工作液，用微量移液器經(jīng)口喂食五齡第3天家蠶幼蟲，每頭家蠶喂食3 μL。以喂食等量的無(wú)菌水為對(duì)照組。取喂食后3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h和24 h家蠶的血淋巴、脂肪體、中腸和絲腺，對(duì)照組同時(shí)取材。每次取樣均設(shè)4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取5頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶液制備 分別取0.3 g的中腸、絲腺和脂肪體迅速放入玻璃勻漿器中，加入500 μL預(yù)冷的巴比妥鈉鹽酸緩沖液(0.04 mol/L，pH值9.7)，在冰上充分研磨勻漿，隨后將勻漿液倒入1.5 mL無(wú)菌離心管中，在4 ℃條件下，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心25 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL無(wú)菌離心管中，即為待測(cè)酶液。取250 μL家蠶血淋巴，加入350 μL預(yù)冷的巴比妥鈉鹽酸緩沖液(0.04 mol/L，pH值9.7)，直接在4 ℃條件下，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，棄沉淀取上清液，即為待測(cè)酶液。

1.3.3 酶活性測(cè)定 酶活性測(cè)定主要參照何華偉等[4]的方法。在1.5 mL無(wú)菌離心管中先加入0.04 mol/L的巴比妥鈉鹽酸緩沖液400 μL和7.5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉100 μL，隨后加入待測(cè)酶液100 μL。置于37 ℃水浴30 min，取出后再加入0.1 mol/L的NaOH溶液400 μL終止反應(yīng)，室溫放置10 min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在405 nm處的吸光值，據(jù)對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線逐一求出每個(gè)單獨(dú)處理的酶活性，最后計(jì)算不同處理組的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016和SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛硫磷對(duì)家蠶脂肪體ALP活性的影響

由圖1可知，在3～12 h，喂食辛硫磷處理組與對(duì)照組家蠶脂肪體ALP活性無(wú)顯著變化，在喂食辛硫磷15 h和18 h，ALP活性極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而在21 h 酶活性開始急劇下降并顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，并且在24 h極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 辛硫磷對(duì)家蠶血淋巴ALP活性的影響

如圖2所示，在喂食辛硫磷后12 h，血淋巴的ALP活性開始增加，并且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；在15 h和18 h酶活性持續(xù)高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的2.2和2.4倍，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；而在21 h酶活性開始急劇降低，其酶活性大小是對(duì)照組的60%，在24 h酶活性降至對(duì)照組的20%，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

2.3 辛硫磷對(duì)家蠶中腸ALP活性的影響

由圖3可以看出，中腸ALP活性在喂食辛硫磷后3 h，與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，但從6 h開始ALP活性顯著增加(P<0.05)，在9 h、12 h和15 h酶活性均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但在喂食辛硫磷18 h后，ALP活性開始顯著下降(P<0.05)，并且在21 h和24 h極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。在測(cè)定的時(shí)間范圍內(nèi)，喂食辛硫磷后家蠶中腸ALP活性整體呈現(xiàn)先增加后減弱的變化趨勢(shì)。

圖2 喂食辛硫磷后家蠶血淋巴ALP活性變化Fig.2 Changes of ALP activity in hemolymph of silkworm after feeding phoxim

圖3 喂食辛硫磷后家蠶中腸ALP活性變化Fig.3 Changes of ALP activity in midgut of silkworm after feeding phoxim

2.4 辛硫磷對(duì)家蠶絲腺ALP活性的影響

圖4結(jié)果顯示，喂食辛硫磷后，家蠶絲腺ALP活性逐漸被抑制，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性急劇減弱。在喂食辛硫磷3 h和6 h，絲腺的ALP活性都是略低于對(duì)照組，但差異未達(dá)到顯著水平；在9 h至24 h酶活性持續(xù)低于對(duì)照組，其中在9 h和12 h酶活性分別下降至對(duì)照組的76%和70%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；而在15 h、18 h、21 h和24 h，ALP活性分別降低至對(duì)照組的57%、48%、39%和13%，且差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

圖4 喂食辛硫磷后家蠶絲腺ALP活性變化Fig.4 Changes of ALP activity in silk gland of silkworm after feeding phoxim

3 結(jié)論與討論

ALP是昆蟲體內(nèi)調(diào)控磷酸代謝的關(guān)鍵酶，在外源化合物和殺蟲劑的解毒代謝過(guò)程發(fā)揮了重要作用。低濃度的螟硫磷能顯著提高云杉色卷蛾幼蟲ALP活性[15]。赤擬谷盜進(jìn)食含有菊酯類殺蟲劑的飼料后，中腸和脂肪體ALP基因表達(dá)量增加，其編碼的堿性磷酸酶活性顯著上升[21]。對(duì)除蟲菊酯類殺蟲劑具有抗性的棉鈴蟲品系，其ALP活性顯著高于敏感品系[22]。唐芬芬等[23]的研究表明，外源蛻皮激素20E 和保幼激素JH均能誘導(dǎo)家蠶血淋巴和中腸ALP基因的表達(dá)，顯著增強(qiáng)ALP活性，暗示ALP在家蠶蛻皮變態(tài)過(guò)程發(fā)揮了一定的作用。本研究結(jié)果顯示，添食辛硫磷后，ALP活性在家蠶不同組織的變化規(guī)律并不一致。不同組織ALP對(duì)辛硫磷的響應(yīng)時(shí)間存在一定的差異。在測(cè)定的時(shí)間范圍內(nèi)，經(jīng)口喂食辛硫磷，其最先接觸和刺激腸道，隨后進(jìn)入脂肪體和血淋巴，最后才會(huì)影響絲腺。所以，中腸組織ALP活性在喂食辛硫磷6 h開始逐漸增加，在15 h達(dá)到最高值，隨后急劇減弱，在24 h極顯著低于對(duì)照組。而血淋巴和脂肪體ALP活性分別是從12 h和15 h開始增加，并且在18 h酶活性均較高，在21 h和24 h酶活性被抑制，顯著低于對(duì)照組。而辛硫磷對(duì)絲腺ALP活性具有顯著的抑制作用，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性急劇減弱。

喂食辛硫磷后，家蠶中腸、脂肪體和血淋巴ALP活性整體呈現(xiàn)先增加后減弱的變化趨勢(shì)，而絲腺ALP活性從9 h開始一直處于被抑制的狀態(tài)。辛硫磷經(jīng)口進(jìn)入蠶體，或多或少都會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定的毒害作用，此時(shí)脂肪體、中腸和血淋巴等組織通過(guò)分泌或激活相關(guān)防御因子及各類水解酶和解毒酶，用于維持蠶體正常的生命代謝活動(dòng)，但隨著機(jī)體各組織遭受辛硫磷毒害程度的加深，蠶體正常生理代謝系統(tǒng)嚴(yán)重紊亂，眾多水解酶和解毒酶的活性被抑制。ALP與蠶體磷酸物質(zhì)的轉(zhuǎn)移、消化、吸收及繭絲蛋白的合成密切相關(guān)。絲腺是家蠶的泌絲器官，而五齡是家蠶絲腺細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)蠶體接觸到辛硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥，絲腺細(xì)胞受損，其合成的ALP活性降低，絲物質(zhì)的分泌量減少，影響繭絲的產(chǎn)量。推測(cè)辛硫磷處理后，絲腺ALP活性顯著降低，可能是家蠶有機(jī)磷農(nóng)藥慢性中毒后不吐絲營(yíng)繭的重要原因。

綜上，用低劑量的辛硫磷處理家蠶，不同組織器官ALP活性變化規(guī)律及其對(duì)辛硫磷的響應(yīng)時(shí)間及受影響程度并不一致。經(jīng)口添食辛硫磷后，家蠶脂肪體、血淋巴和中腸ALP活性呈現(xiàn)先顯著升高后急劇降低的變化趨勢(shì)，而絲腺組織ALP活性從9 h開始顯著降低，并一直處于被抑制狀態(tài)。提示中腸、脂肪體和血淋巴ALP在家蠶代謝辛硫磷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，而絲腺ALP并不參與這個(gè)過(guò)程。本研究添食辛硫磷的劑量相對(duì)較低，ALP活性測(cè)定也僅僅局限在處理后的24 h內(nèi)。在設(shè)定的測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi)，蠶體并未出現(xiàn)明顯病變及異常生理狀況。今后，要明確ALP活性對(duì)家蠶吐絲營(yíng)繭以及繭絲產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，有必要對(duì)辛硫磷的劑量和處理時(shí)間進(jìn)行更深入細(xì)致的探索和研究。