李 蒙，劉 璞，張芝星

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

抗菌肽(Antimicrobial Peptide)是一類具有抗菌活性的小分子多肽的總稱，是由宿主產(chǎn)生的能夠抵抗外界病原體感染，抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對細菌有很強的殺傷作用，尤其是其對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視[1]。廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在微生物、植物和動物體中均有發(fā)現(xiàn)并成功分離獲得。直接從生物體內(nèi)提取抗菌肽產(chǎn)量低、費時長、工藝復(fù)雜[2-6]。因此，通過分子生物學(xué)技術(shù)合成人工抗菌肽是高效制備的理想選擇。

蕎麥(FagopyrumesculentumMoench.)是一種藥食兼用的經(jīng)濟作物，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能，如防癌、降血糖、降血脂、抗衰老等多種生理功能。其中，蛋白質(zhì)作為蕎麥中重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌等不同生理活性[7]。Zhang等[8]將蕎麥抗菌肽編碼基因在原核系統(tǒng)重組表達，表達產(chǎn)物rBT對IM-9細胞系等具有生長抑制活性。趙紅倩等[9]通過Plackett-Burman和Box-hnken試驗并聯(lián)優(yōu)化苦蕎蛋白酶解制備抗菌肽，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用。并且發(fā)現(xiàn)其不但可以抑制肝癌細胞HepG2、肺癌WRL68、白血病L1210等細胞的生長，甚至可以抑制艾滋病病毒HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶活性[10]。因此，蕎麥抗菌肽是多功能活性肽，在抵抗微生物感染、提高機體免疫力等研究領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。

目前，已在多種植物中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽，F(xiàn)ujimura等[11]首次從甜蕎中分離得到了Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽，兩者在結(jié)構(gòu)中十分相似，僅在C端有一個氨基酸差異，具體的分子結(jié)構(gòu)有待進一步闡明。本研究擬通過基因工程手段獲得蕎麥Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽的原核表達菌株，為高效制備具有生物活性蕎麥抗菌肽的開發(fā)利用提供重要的研究手段。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pET-47b(+)、大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和DH5α均由西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院實驗室保存。

1.2 試劑

BamHⅠ、XhoⅠ核酸限制性內(nèi)切酶，DNA分子量Marker；pGM-T Vector載體；Taq PCR Mastermix；DNA純化試劑盒；質(zhì)粒提取試劑盒。

1.3 抗菌肽基因設(shè)計及引物合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中抗菌肽Fa-AMP1(accession P0DKH7.1)和Fa-AMP2(accession P0DKH8.1)蛋白質(zhì)序列分析，采用大腸桿菌中密碼子偏嗜性設(shè)計抗菌肽的核苷酸，F(xiàn)a-AMP1氨基酸序列(AQCGAQGGGATCPGGLCCSQWGWCG STPKYCGAGCQSNCK)，F(xiàn)a-AMP2氨基酸序列(AQCGAQGGGATCPGG LCCSQWGWCGSTPKYCGAGCQSNCR)，F(xiàn)a-AMP1核苷酸序列(5′-GCTC AATGTGGTGCTCAAGGTGGTGGTGCTACCTGTCCTGGTGGT TTGTGTTGTTCTCAATGGGGTTGGTGTGGTTCTACCC CAAAGTACTGTGGTGCTGGTTGTCAATCTAACTGTAA A-3′)；Fa-AMP2核苷酸序列(5′-GCTCAATGTGGT GCTCAAGGTGGTG GTGCTACCTGTCCTGGTGGTTTGTGTTGTTCTCAATGGGGTTGGTGTGGTTCTACCCCA AAGTACTGTGGTGCTGGTTGTCAATCTAACTGTAGA-3′)。

1.4 抗菌肽基因的合成和原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)Fa-AMP1和Fa-AMP2優(yōu)化后的核苷酸序列，設(shè)計具有互補重疊區(qū)的引物，利用Vector NTI軟件設(shè)計的5條互補引物(表1)，分別為Fa1、Fa2、Fa3、Fa4、Fa5引物，采用重疊區(qū)擴增基因拼接法，多步PCR獲得目的基因。

Fa-AMP1抗菌肽基因獲得的PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Fa1、Fa2、Fa3、Fa4這4種引物各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(each10 mmol/L)0.5 μL，Pfu DNA酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。Fa-AMP2抗菌肽基因獲得的反應(yīng)體系(25 μL)：Fa1、Fa2、Fa3、Fa5這4種引物各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(each10 mmol/L)0.5 μL，Pfu DNA酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。

PCR程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。經(jīng)Tap酶擴增連接到pGM-T Vector載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,陽性克隆經(jīng)PCR和測序(上海生物工程公司)鑒定。

表1 合成Fa-AMP基因的引物

Fa-AMP1和Fa-AMP2經(jīng)測序鑒定正確后，重新設(shè)計帶有BamHⅠ和XhoⅠ核酸限制性內(nèi)切酶的上下游引物，F(xiàn)a-AMP1和Fa-AMP2的上游引物(5′-ACTCGGGATCCGGCTCAATGTGGTGCTCAAGGTGGTG-3′，下劃線為BamHⅠ酶切位點)，F(xiàn)a-AMP1的下游引物(5′-ACACCGCTCGAGTTTACAGTTAGATTGACAACCA GC-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點)，F(xiàn)a-AMP2的下游引物(5′-ACACCGCTCGAGTCTACAGTTAGATTGACAACCAGC-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點)；以測序正確的基因為模板進行PCR擴增，擴增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s(Fa-AMP1為65 ℃，F(xiàn)a-AMP2為64 ℃)，72 ℃延伸20 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。使用核酸限制性內(nèi)切酶對純化的PCR產(chǎn)物和原核表達質(zhì)粒pET-47b(+)進行雙酶切，酶切后構(gòu)建重組真核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，對再次重組的表達載體進行測序。

1.5 序列比對與分析

利用ExPASy在線進行氨基酸序列分析(https://web.expasy.org/translate/)，等電點及分子量預(yù)測(https://web.expasy.org/protparam/)；在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行氨基酸序列比對；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；空間結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的鑒定

Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽基因的多步PCR擴增產(chǎn)物，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，由圖1和圖2可知，100～250 bp間有特異性條帶，符合預(yù)期結(jié)果，連接到pGM-T Vector載體測序結(jié)果也表明與實驗前期設(shè)計的Fa-AMP1和Fa-AMP2抗菌肽基因一致，在線軟件預(yù)測Fa-AMP1和Fa-AMP2的重組蛋白分子量分別為6.49和6.52 kDa，等電點為6.97。

M:DL2000；1～4：Fa-AMP1基因的PCR擴增結(jié)果。圖1 Fa-AMP1基因的PCR擴增結(jié)果

2.2 基因與載體的酶切

使用核酸限制性內(nèi)切酶對純化的Fa-AMP1和Fa-AMP2基因和原核表達載體pET-47b進行雙酶切及檢測(圖3和圖4)，酶切成功后進行連接。

2.3 構(gòu)建重組表達載體

連接轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建的重組表達載體pET-47b+Fa-AMP1和pET-47b+Fa-AMP2進行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(圖5)，100～250 bp間有特異性條帶，符合預(yù)期結(jié)果，重組表達載體測序結(jié)果顯示構(gòu)建成功。

M:DL2000；1:pET-47b的雙酶切結(jié)果。圖4 質(zhì)粒pET-47b的雙酶切結(jié)果

M:DL2000；1：Fa-AMP1重組質(zhì)粒PCR擴增結(jié)果；2：Fa-AMP2重組質(zhì)粒PCR擴增結(jié)果；3：pET-47b+Fa-AMP1重組質(zhì)粒； 4：pET-47b+Fa-AMP2重組質(zhì)粒。

2.4 生物信息學(xué)分析

獲得基因通過NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，結(jié)果顯示氨基酸序列一致，通過SOPMA對Fa-AMP1和Fa-AMP2進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在它們的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋所占比例為5%和2.5%，β折疊所占比例為15%，無規(guī)則卷曲所占比例為80%和82.5%，說明其蛋白的二級結(jié)構(gòu)以β折疊和無規(guī)則卷曲為主。利用在線ExpASy的SWISS-MODEL對其進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示是多肽的無規(guī)則卷曲(圖6)。

圖6 抗菌肽Fa-AMP的三級空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

抗菌肽是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，由特定基因編碼，具有廣譜抗菌活性，除了具有抗細菌作用外，還具有抗真菌、抗腫瘤活性、抗病毒、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等功效[12]，它是具有生物學(xué)活性的多個氨基酸組成的多肽[13]，深入研究蕎麥小分子活性肽，對于蕎麥蛋白資源的開發(fā)利用具有重要的意義。

植物抗菌肽在一級結(jié)構(gòu)方面相當(dāng)保守序列，即分子內(nèi)都含豐富的分子內(nèi)二硫橋，二硫橋是體外合成多肽技術(shù)面臨的重要難題[14]。人工合成雖可獲得與天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正確的空間結(jié)構(gòu)，且成本昂貴，使其僅停留在實驗室試驗階段，同樣，體外分離天然抗菌肽或抗菌蛋白也是費時費力。因此，本次實驗通過基因工程的方法成功構(gòu)建蕎麥抗菌肽的原核表達載體pET-47b+Fa-AMP1和pET-47b+Fa-AMP2，下一步進行體外表達是短時間得到大量抗菌肽產(chǎn)物的好方法；為獲得具有生物活性的抗菌肽，后續(xù)實驗可通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件，選擇合適的融合蛋白標簽進行體外表達，是短時間獲得具有生物活性且規(guī)模化生產(chǎn)制備抗菌肽的理想選擇。