王維 ，賈曉華 ，高夢(mèng)園 ，歐陽慧子 ，何俊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

細(xì)辛為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag.、漢城細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或華細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根和根莖。細(xì)辛作為中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為馬兜鈴科細(xì)辛屬多年生草本植物，其性溫味辛，歸心、肺、腎經(jīng)，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲等功效，主治風(fēng)寒感冒、頭痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、風(fēng)濕痹痛、痰飲喘咳等癥[1-2]。

細(xì)辛的化學(xué)成分有揮發(fā)油類、黃酮類、木脂素類、生物堿及酰胺類、有機(jī)酸類、氨基酸類化合物等[3]，其中揮發(fā)油類化合物是細(xì)辛中的一類重要成分，具有較強(qiáng)的藥理活性?，F(xiàn)代研究表明細(xì)辛揮發(fā)油具有解熱，鎮(zhèn)痛，鎮(zhèn)靜，催眠，抗驚厥，局部麻醉，強(qiáng)心，抗炎，抗菌[4-9]等多種藥理作用。為了更加全面地了解細(xì)辛中的揮發(fā)性成分，本實(shí)驗(yàn)分別采用水蒸氣蒸餾法和頂空進(jìn)樣法從細(xì)辛中提取揮發(fā)油，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）的分析方法對(duì)兩種不同提取方法獲得的細(xì)辛揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析與比較，為細(xì)辛揮發(fā)性成分的研究和開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器：GCMS-QP2010 Ultra型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本Shimadzu公司）；Shimadzu GCMSsolution工作站（日本Shimadzu公司）；AS 60/220.R2型十萬分之一天平（波蘭RADWAG公司）；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；G3KT18273型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）；5424 R型高速控溫離心機(jī)（Eppendorf公司）；ZZ-L6DT超聲波清洗機(jī)。

試劑：正己烷（色譜純）購自天津市康科德科技有限公司。

藥材：細(xì)辛產(chǎn)自遼寧省鐵西市，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)何俊研究員鑒定其基原為北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag.的干燥根和根莖。藥材經(jīng)粉碎后，過3號(hào)篩，保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院。

2 方法

2.1 揮發(fā)性成分的提取 水蒸氣蒸餾法：精密稱取50.0 g剪碎的細(xì)辛藥材，置燒瓶中，加水400 mL與數(shù)粒玻璃珠，振搖混合后，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時(shí)為止。置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸6 h，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測(cè)定器下端的活塞，將水緩緩放出，收集上層細(xì)辛揮發(fā)油。實(shí)驗(yàn)得到淺綠色透明具有特殊濃郁氣味的油狀液體，以無水硫酸鈉干燥，得油率為1.4%。取所得到的揮發(fā)油1 μL，置于10 mL容量瓶，加正己烷定容至刻度，渦旋混勻即得，4°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

頂空進(jìn)樣：精密稱取1.0 g細(xì)辛藥材（經(jīng)粉碎），置于20 mL頂空瓶中，橡膠密封墊及鋁蓋封口，放入頂空進(jìn)樣器中按頂空進(jìn)樣條件進(jìn)樣分析。頂空進(jìn)樣條件：樣品平衡溫度100℃，平衡時(shí)間20 min，定量管溫度120℃，傳輸線溫度140℃，載氣為高純氦氣，加壓時(shí)間0.1 min，進(jìn)樣時(shí)間1 min。

2.2 GC-MS分析條件 色譜條件：色譜柱DB-17毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣，柱流量為1.3 mL/min。升溫程序：初始溫度40℃，保持3 min；以6℃/min升溫至106℃；以3℃/min升溫至142.6℃，保持1 min；以6℃/min升溫至180℃；以4℃/min升溫至200℃；再以2℃/min升溫至235℃。進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為50∶1；進(jìn)樣量：0.4 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），采用Scan監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行掃描，離子源溫度：230℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲時(shí)間：3.8 min。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)辛揮發(fā)性成分鑒定 按2.2節(jié)分析條件，對(duì)細(xì)辛揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，其GC-MS總離子流圖見圖1，以峰面積歸一化法計(jì)算細(xì)辛揮發(fā)油各組分的相對(duì)含量。對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得質(zhì)譜圖，采用化學(xué)工作站對(duì)各峰質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST08和NIST08s標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，人工譜圖解析，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)細(xì)辛揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，結(jié)果見表1。

表1 水蒸氣蒸餾法和頂空進(jìn)樣法細(xì)辛揮發(fā)油GC-MS成分分析結(jié)果Tab.1 GC-MS analysis results of Asarum heterotropoides volatile components extracted by steam distillation and headspace injection

圖1 細(xì)辛揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of Asarum heterotropoides volatile components

3.2 不同提取方法所得的細(xì)辛揮發(fā)性化學(xué)成分的定性比較與分析 本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS對(duì)水蒸氣蒸餾提取法和頂空進(jìn)樣法制備的細(xì)辛揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析。比較兩種方法提取到的揮發(fā)性成分可知：采用水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中分離鑒定出35種化合物，占揮發(fā)性成分總相對(duì)含量的33.75%，其中相對(duì)含量大于2%的組分有3種，分別為甲基丁香酚（11.97%）、3-蒈烯（3.64%）、黃樟醚（2.61%）；采用頂空進(jìn)樣GC-MS分析，分離鑒定出66種化合物，占揮發(fā)性成分總含量的87.16%，其中相對(duì)含量大于2%的組分有11種，分別為黃樟醚（11.27%）、甲基丁香酚（10.37%）、鄰苯二甲酸二乙酯（8.49%）、正十六烷（7.60%）、3，5-二甲氧基甲苯（7.51%）、2，4，6-三甲氧基甲苯（5.41%）、3，4，5-三甲氧基甲苯（4.19%）、右旋龍腦（3.74%）、β-蒎烯（3.30%）、α-蒎烯（3.18%）、優(yōu)葛縷酮（2.37%）。

比較測(cè)得的揮發(fā)性成分種類和相對(duì)含量可知水蒸氣蒸餾法檢測(cè)到的化合物包含萜烯類、苯丙類、醇類、醚類、酮類、酚類、醛類和其它類化合物，其中相對(duì)含量較高的是酚類成分12.16%，萜烯類成分8.36%，苯丙類成分4.92%；頂空進(jìn)樣法檢測(cè)到的化合物包含萜烯類、苯丙類、烷烴類、醇類、醚類、酮類、酚類、醛類、酯類、脂肪酸類和其它類化合物，其中相對(duì)含量較高的是苯丙類成分18.38%，醚類成分12.86%，萜烯類成分11.71%。

2種方法共鑒定出73種化合物，其中有28種共有化合物（α-蒎烯、茨烯、β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、（+）-檸檬烯、水芹烯、γ-松油烯、萜品油烯、芳樟醇、（S）-順式-馬鞭草烯醇、右旋龍腦、優(yōu)葛縷酮、α-松油醇、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、草蒿腦、2-異丙基-5-甲基茴香醚、（-）-α-蒎烯、馬芐烯酮、3，5-二甲氧基甲苯、黃樟醚、百里醌、甲基丁香酚、3，4，5-三甲氧基甲苯、2，4，6-三甲氧基甲苯、肉豆蔻醚、5，6-二甲氧基-1-茚酮、欖香素），這些共有化合物占水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油總含量的31.46%，占頂空進(jìn)樣法提取的揮發(fā)油總含量的61.55%。

根據(jù)以上的結(jié)果可知，使用2種方法提取的細(xì)辛揮發(fā)油成分的種類和含量差異較大，推測(cè)造成這種差異可能與樣品處理方法不同有關(guān)。采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的過程中提取時(shí)間較長，加熱溫度較高，通過冷凝回流收集揮發(fā)性成分時(shí)可能損失掉了很多易揮發(fā)及熱不穩(wěn)定的揮發(fā)性成分。而頂空進(jìn)樣GC-MS分析細(xì)辛藥材揮發(fā)油組分，通過將細(xì)辛粉碎后直接裝入頂空樣品瓶中，密封處理，加熱平衡后，揮發(fā)性氣體直接進(jìn)樣分析，加熱時(shí)間較短，提取溫度較低，可以降低一些化學(xué)成分在加熱過程中分解與轉(zhuǎn)化的可能性，同時(shí)沒有外部環(huán)境對(duì)樣品的可能作用，更能直接反映出細(xì)辛中的揮發(fā)性物質(zhì)。

4 討論

文獻(xiàn)中有關(guān)細(xì)辛揮發(fā)性成分研究的提取方法有水蒸氣蒸餾法[10]、超臨界CO2流體提取法[11]、微波輔助提取法[11]、索氏提取法[12]和超聲輔助提取法[13]等。與這些方法相比，頂空進(jìn)樣可在一定時(shí)間內(nèi)使揮發(fā)性成分從藥材中揮發(fā)后直接進(jìn)樣，減少了提取揮發(fā)油所需要的萃取等步驟，具有操作簡單、快速、無溶劑殘留且節(jié)省藥材等優(yōu)點(diǎn)，可用于細(xì)辛揮發(fā)性成分的研究。文章通過使用水蒸氣蒸餾和頂空進(jìn)樣兩種方法，對(duì)得到的細(xì)辛揮發(fā)性成分與以往的研究結(jié)果[14-18]進(jìn)行比對(duì)，鑒定出細(xì)辛中新的揮發(fā)性成分23個(gè)，其中頂空進(jìn)樣法鑒定得到15個(gè)成分：糠醛、（-）-反式-松香芹烯、α-氧化蒎烯、檸檬醛、（1R）-（+）-諾蒎酮、金絲娘烯酮、桃金娘烯醛、羅漢柏烯、B-柏木烯、（-）-異長葉醇、佛木烯、鄰苯二甲酸二乙酯、松香芹酮、2-蒈烯、醋酸檜酯；水蒸氣蒸餾法鑒定得到5個(gè)成分：2-異丙烯基甲苯、葑醇、1，3-二叔丁基苯、2，4-二叔丁基苯酚、1-羥基環(huán)己基苯基甲酮；兩種方法鑒定得到3個(gè)共有成分：2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、百里醌、5，6-二甲氧基-1-茚酮。

本研究評(píng)價(jià)了水蒸氣蒸餾法與頂空進(jìn)樣法對(duì)細(xì)辛揮發(fā)油檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果表明兩種方法提取到的細(xì)辛揮發(fā)性成分差異明顯，因此在采用GCMS對(duì)細(xì)辛揮發(fā)性成分進(jìn)行分析時(shí)，可采用兩種方法制備揮發(fā)油，將兩種提取方法獲得的GC-MS分析結(jié)果相結(jié)合，能夠獲得更加全面、具體的細(xì)辛揮發(fā)性成分的信息。