李艷華 ，姜威 ，劉君 ，薛曉鷗

（1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2.上海市嘉定區(qū)牙病防治所，上海 201800；3.北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

卵巢儲備功能減退（DOR）是指由于卵巢內(nèi)可募集的有效卵泡數(shù)目減少，或者卵母細胞數(shù)量下降，引起月經(jīng)量減少、月經(jīng)稀發(fā)或者卵巢早衰，從而導致生育力下降的的現(xiàn)象[1]。DOR是一種女性內(nèi)分泌紊亂的疾病，致病因素較多，主要包括遺傳、環(huán)境、免疫、心理、生活習慣等。DOR患者伴有不同程度的心理壓力[2]，不良情緒會加重病情的發(fā)展。根據(jù)中醫(yī)學理論，可將“卵巢儲備功能減退”歸類為“不孕”“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過少”等范疇，主要病機為腎虛，兼有肝郁、血瘀、脾虛等中的一項或多項。其中以腎虛肝郁型最為常見，治療方法多為補腎疏肝法[3-4]。本團隊致力于補腎疏肝法聯(lián)合五行音樂治療DOR，并且在臨床上已經(jīng)取得了良好的效果，為進一步探討其作用機制，開展了一系列的動物實驗。研究旨在探討補腎疏肝方聯(lián)合五行音樂對卵巢儲備功能減退大鼠的效果，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 將54只性成熟的、有規(guī)律動情周期的雌性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、補佳樂組、中藥低劑量加音樂組、中藥中劑量加音樂組、中藥高劑量加音樂組，每組9只，12周齡，體質(zhì)量（200±10）g。實驗大鼠均購自維通利華實驗中心。所有實驗均在北京中醫(yī)藥大學實驗中心進行。

1.2 試劑與儀器 蘇木精-伊紅（HE）染色液，促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）放射免疫試劑盒；曠場箱（自制）：長寬各100 cm，高60cm，底部劃分25個等面積方格，內(nèi)面均用黑漆涂黑；三洋制冰機，高速離心機，電子天平，切片機，石蠟包埋機，病理圖像采集系統(tǒng)等。

1.3 藥品 補腎疏肝方組成：當歸15g，熟地黃15g，白芍 15 g，赤芍 15 g，川芎 10 g，黨參 15 g，炒白術(shù)15 g，菟絲子 15 g，女貞子 15 g，川續(xù)斷 15 g，玫瑰花15 g，月季15 g；補佳樂，每片1 mg，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；雷公藤多苷片，每片10 mg，遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司。按照人與大鼠劑量換算[5-6]，將補腎疏肝方用蒸餾水分別配成 0.9 g/mL、3.6 Lg/mL、1.8 g/mL的溶液；補佳樂灌胃量為0.09 mg/（kg·d）；雷公藤多苷片灌胃量為50 mg/（kg·d）；每天按照10 mL/kg體積灌胃。藥物均購自北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院藥房。五行音樂：選用《中國傳統(tǒng)五行音樂（正調(diào)式）》音樂光盤（中華醫(yī)學電子音像出版社出版）中的角調(diào)、羽調(diào)（由中央音樂學院樂團演奏，時長45 min）。操作時，周圍環(huán)境安靜，溫度、音量適當，兩種調(diào)式隔日播放，每日1次，每次45 min，連續(xù)21 d。

1.4 模型制備與給藥 采用慢性輕度不可預見性應激（CUMS）[7]并稍加改進聯(lián)合雷公藤多苷片灌胃的方法進行造模，刺激因子包括10種：孤籠喂養(yǎng)；潮濕墊料；夾尾刺激1 min；0℃冰水游泳5 min；禁食 24 h；禁水 24 h；黑白顛倒（黑暗 12 h，白晝 12 h）；45°傾斜鼠籠；禁食水24 h；異物刺激24 h（如硬木棍，碎布片等）。10種刺激隨機安排，使大鼠無法預測刺激的發(fā)生，每日1次，同時給予雷公藤多苷片50 mg/kg灌胃，連續(xù)21 d。空白組不給予以上任何刺激，食水、光照充足，安靜喂養(yǎng)。

模型成功后，空白組大鼠正常進食水，模型組給予生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)21 d；補佳樂組給予補佳樂0.09 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)21 d；中藥低、中、高劑量加音樂組分別給予補腎疏肝中藥 0.9 g/mL、3.6 g/mL、1.8 g/mL 灌胃，同時播放五行音樂45 min/次，每日1次，連續(xù)21 d。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況 每日觀察各組大鼠的一般情況（大便、活動情況、毛色、精神、進食水量）。

1.5.2 動情周期 實驗開始后，每日上午10時進行大鼠陰道脫落細胞涂片，用移液器吸取生理鹽水30 μL，注入大鼠陰道內(nèi)并反復抽吸3～5次，將其涂于事先標記好的載玻片上，待晾干后用95%乙醇固定30 min，再用瑞氏-姬姆薩復合染液染色后在光學顯微鏡下觀察脫落細胞的形態(tài)，以確定大鼠所處動情周期階段，通過連續(xù)涂片判定大鼠的動情周期的情況，包括正常、延長、停滯和無周期。

1.5.3 行為學檢測 糖水實驗及曠場實驗 所有大鼠單籠喂養(yǎng)，在第1個24 h里，每籠放置兩個飲水瓶，均裝有1%蔗糖水；在第2個24 h里，每籠放置兩個飲水瓶，1個裝蔗糖水，另1個裝蒸餾水；第3個24 h里，禁食水；開始糖水實驗：每籠放置兩個50 mL飲水瓶，1個含1%蔗糖水，一個含蒸餾水，1 h后取走兩瓶，并稱質(zhì)量。于實驗第21、42天給予糖水實驗。糖水偏嗜度=蔗糖水消耗量/（蔗糖水消耗量+蒸餾水消耗量）×100%；將大鼠放入自制的曠場箱中，自由活動5 min，計算大鼠在中央格子的停留時間。于實驗第21、42天給予曠場實驗。

原有的2臺80 m3反應槽，1#槽作為一段一次除銅、預除鎘反應槽，反應35 min，吹制鋅粉加入量為液體銅金屬量的80%，置換大部分銅，固液分離，控制一段一次凈化后液銅鎘比滿足1～3，達到最佳的除鎘效率。

1.5.4 放射免疫法檢測血清性激素 采用放射免疫法檢測大鼠血清E2、FSH、LH水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，將標準品及樣本加標記物抗體后靜置，并于4℃環(huán)境中溫育20 h，3 800 r/min，離心半徑180 mm，離心15 min，取沉淀物待測。

1.5.5 計算卵巢指數(shù) 取下大鼠卵巢，剝離干凈周圍組織，稱質(zhì)量。卵巢指數(shù)：卵巢指數(shù)=卵巢濕質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%

1.5.6 HE染色觀察卵巢形態(tài)及卵泡計數(shù) 取甲醛固定的卵巢組織，進行脫水、包埋、切片，HE染色后，將組織切片置于光學顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)，并計算各級卵泡數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組內(nèi)前后比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 實驗過程中，空白組大鼠始終狀態(tài)良好，被毛光滑，飲食、飲水正常；模型組大鼠被毛稀松，飲食、飲水均減少。與模型組相比，補佳樂組，中藥低、中、高劑量聯(lián)合音樂組上述表現(xiàn)有所改善。

2.2 大鼠卵巢指數(shù)變化情況 與空白組比較，模型組大鼠卵巢指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量聯(lián)合音樂組及補佳樂組大鼠卵巢指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中藥低劑量聯(lián)合音樂組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其中補佳樂組與中藥高劑量聯(lián)合音樂組變化較為明顯；與補佳樂組比較，中藥低、中、高劑量聯(lián)合音樂組大鼠卵巢指數(shù)變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 各組大鼠卵巢指數(shù)（±s）Tab.1 Ovarian index of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠卵巢指數(shù)（±s）Tab.1 Ovarian index of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 卵巢指數(shù)（mg/g，%）空白組 9 49.41±2.66模型組 9 42.17±2.31*中藥低劑量聯(lián)合音樂組 9 44.73±1.58中藥中劑量聯(lián)合音樂組 9 45.68±1.71#中藥高劑量聯(lián)合音樂組 9 47.49±2.17#補佳樂組 9 48.57±1.26#

表2 各組大鼠動情周期、糖水偏嗜度（±s）Tab.2 Estrus cycle and sugar water preference of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠動情周期、糖水偏嗜度（±s）Tab.2 Estrus cycle and sugar water preference of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 動情次數(shù)（次） 糖水偏嗜度（%）實驗第21天 實驗第42天 實驗第21天 實驗第42天空白組 9 4.16±0.31 4.26±0.28 72.36±1.17 77.36±1.17模型組 9 3.27±0.47* 3.67±0.55* 60.31±3.81* 70.47±1.28*中藥低劑量聯(lián)合音樂組 9 3.16±0.52* 3.92±0.19 61.13±2.06* 71.07±1.15中藥中劑量聯(lián)合音樂組 9 3.43±0.28* 4.11±0.25# 60.52±1.41* 71.76±1.59#中藥高劑量聯(lián)合音樂組 9 3.38±0.18* 4.37±0.21# 61.37±1.55* 73.36±1.47#補佳樂組 9 3.19±0.22* 4.33±0.57# 60.76±1.59* 73.41±1.15#

表3 各組大鼠曠場實驗結(jié)果（±s）Tab.3 Open field test results of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠曠場實驗結(jié)果（±s）Tab.3 Open field test results of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 曠場實驗（實驗第21天） 曠場實驗（實驗第42天）水平（次） 垂直（次） 水平（次） 垂直（次）空白組 9 81.71±4.27 19.49±1.68 82.58±3.16 18.37±1.72模型組 9 68.59±6.54* 16.27±1.19* 74.48±4.36* 17.31±1.41*中藥低劑量聯(lián)合音樂組 9 67.32±5.43* 16.13±1.24* 78.58±3.86 17.93±1.27中藥中劑量聯(lián)合音樂組 9 67.16±6.28* 15.47±1.57* 79.18±4.39# 18.04±1.12#中藥高劑量聯(lián)合音樂組 9 68.09±4.63* 16.12±1.38* 80.27±3.72# 18.33±1.39#補佳樂組 9 67.37±5.33* 15.87±1.51* 80.16±4.12# 18.47±1.07#

2.4 大鼠E2、FSH、LH情況 ELISA結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠E2降低、FSH升高、LH升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，中藥高劑量聯(lián)合音樂組和補佳樂組，E2升高，F(xiàn)SH降低、LH 降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中藥低、中劑量聯(lián)合音樂組E2升高，F(xiàn)SH降低、LH降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中藥低、中、高劑量聯(lián)合音樂組與補佳樂組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 4。

表4 各組大鼠 E2、FSH、LH（±s）Tab.4 E2，F(xiàn)SH，LH of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠 E2、FSH、LH（±s）Tab.4 E2，F(xiàn)SH，LH of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

LH（mIU/mL）空白組 9 64.46±6.72 2.17±0.82 4.38±1.62模型組 9 44.39±5.41* 3.86±1.71* 6.17±2.12*中藥低劑量聯(lián)合音樂組 9 53.29±5.74 2.23±1.04 4.36±1.82中藥中劑量聯(lián)合音樂組 9 56.32±5.74 2.41±1.57 4.74±1.17中藥高劑量聯(lián)合音樂組 9 57.57±6.34# 2.36±1.27# 5.67±1.63#補佳樂組 9 54.79±6.72# 2.95±1.14# 4.87±1.42#組別 動物數(shù) E2（pmol/L）FSH（IU/L）

2.5 大鼠卵巢病理情況 空白組，卵巢組織內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，各級卵泡清晰可見，卵丘形態(tài)正常，內(nèi)見較多卵泡液，顆粒細胞較豐富，間質(zhì)血管較充盈，未見炎性細胞浸潤。模型組，卵巢組織結(jié)構(gòu)欠清晰，卵泡數(shù)目少，卵泡液含量較少，顆粒細胞層數(shù)減少，卵丘變形，少部分間質(zhì)血管擴張，可見炎性細胞浸潤。西藥組與中藥高劑量聯(lián)合音樂組結(jié)構(gòu)較為相似，卵巢組織內(nèi)結(jié)構(gòu)較清晰，可見初級、次級卵泡，卵丘形態(tài)較正常，可見中量顆粒細胞，間質(zhì)血管較充盈，見極少量炎性細胞浸潤。中藥低、中劑量聯(lián)合音樂組差異不明顯，卵巢組織內(nèi)結(jié)構(gòu)較清晰，可見次級卵泡，卵丘形態(tài)較正常，可見少量顆粒細胞，見少量炎性細胞浸潤。與模型組相比，中藥低、中、高劑量聯(lián)合音樂組和西藥組情況有所改善；與補佳樂組比較，中藥低、中、高劑量聯(lián)合音樂組卵巢HE切片結(jié)果不明顯，見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織病理情況（HE染色，×40）Fig.1 Pathological changes of ovarian tissue of rats in each group（HE staining，×40）

3 討論

卵巢儲備功能減退的根本病機為腎虛，補腎療法在臨床上也取得了一定的療效。研究表明，女性卵巢功能減退與快節(jié)奏及高社會壓力的生活息息相關(guān)，社會心理因素受到越來越多的重視[8]。因此，在DOR的治療中，除了補腎，還要考慮疏肝、心理疏導。筆者在跟師的過程中也比較多見這類患者，但是對腎虛肝郁型卵巢儲備功能下降的實驗研究較少，尤其是腎虛肝郁型DOR大鼠模型[9]。因此，本文旨在探索慢性應激狀態(tài)聯(lián)合雷公藤多苷片對卵巢儲備的功能的影響，以及應用補腎疏肝藥物聯(lián)合音樂治療，并觀察其療效。

音樂療法作為心理療法之一，可以提高大腦皮層神經(jīng)興奮性，在一定程度上緩解患者抑郁焦慮的情緒[10]。中醫(yī)五行音樂，將中醫(yī)陰陽五行、天人合一理論與音樂有機結(jié)合，角、徵、宮、商、羽五種調(diào)式分別對應肝、心、脾、肺、腎五臟，音樂的旋律振動與機體的振動產(chǎn)生共鳴，與內(nèi)在臟腑、情志相吻合，從而達到調(diào)暢氣機，梳理情志的作用[11]。文章中五行音樂與疏肝藥物共同起到疏肝的作用，因此在該實驗中，補腎疏肝藥物與音樂結(jié)合作為一種整體療法，故而實驗分組中未做與音樂的對照。

CUMS法制造動物肝郁模型，是目前比較常用的方法，模型成功率較高，造模過程中死亡率較低[12-13]。本實驗中造模結(jié)束后，與空白組比較，其余5組大鼠造模后出現(xiàn)動情次數(shù)減少、糖水偏嗜度下降、直立及垂直次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明慢性復合刺激導致了大鼠的肝郁狀態(tài)。雷公藤制劑是一類臨床應用較為廣泛的免疫抑制劑，具有生殖毒性，會對卵巢功能造成不同程度的損傷，常用來建立卵巢功能損傷的模型[14-16]。實驗中造模結(jié)束后，與空白組比較，各組大鼠出現(xiàn)被毛稀松，飲食、飲水均減少，活動量低等腎虛的表現(xiàn)；模型組大鼠E2下降、FSH于LH均升高，差異顯著（P＜0.05），且卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目減少，顆粒細胞分級減少，提示大鼠卵巢儲備功能下降。因此，CUMS法聯(lián)合雷公藤多苷片造模，結(jié)果顯示模型具有腎虛肝郁傾向，也是該類復合模型的初探，以期對此類研究有一定的幫助。

文章運用補腎疏肝法對腎虛肝郁型卵巢儲備功能減退大鼠進行干預，治療后與模型組比較，中藥低、中、高劑量聯(lián)合音樂組與補佳樂組E2均升高，F(xiàn)SH與LH均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示補腎疏肝藥物對腎虛肝郁型卵巢儲備功能減退大鼠有一定的療效。治療前后組內(nèi)比較，治療后補佳樂組、中藥高劑量聯(lián)合音樂組大鼠動情次數(shù)增加、糖水偏嗜度升高、水平及直立次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余各組大鼠差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但中藥低劑量聯(lián)合音樂組大鼠在治療前后動情次數(shù)均增加、糖水偏嗜度均增高、水平及直立次數(shù)均增加，提示藥物干預對促進模型的恢復有一定的作用。與模型組比較，其余各組卵巢病理切片顯示卵泡形態(tài)較好，顆粒細胞分級增多，尤其是補佳樂組和中藥高劑量聯(lián)合音樂組，提示補腎疏肝藥物聯(lián)合音樂對促進卵巢功能的恢復有一定的作用，其中以中藥高劑量聯(lián)合音樂組效果明顯。

腎主生殖，主藏精，女性的生殖功能依賴于腎精的充盛；肝主疏泄，調(diào)暢氣機，“女子以肝為先天”，氣機順暢，方能促使腎精滋養(yǎng)全身，氣血充足，月水盈虧有序[17]。在臨床治療中，應該注重補腎精、疏肝氣，加強心理疏導和生活方式的指導，更好的保護卵巢功能。文章運用補腎疏肝藥物聯(lián)合五行音樂對腎虛肝郁型卵巢儲備功能減退大鼠進行療效觀察，療效確切，但作為對該復合模型的初探，尚有一些不足之處，比如實驗條件控制的嚴格與否、有沒有有效驗證復合模型的指標等，需要進一步研究，以期為臨床治療女性卵巢儲備功能下降提供一些思路。