韓心語(yǔ)，鄧建峰，張麗霞，劉 倩，王 穎，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌（Riemerel

la anatipestifer，RA）引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病，臨床上又稱鴨傳染性漿膜炎病。該病主要侵害1～8 周齡雛鴨，死亡率可達(dá)80%。鴨疫里氏桿菌容易產(chǎn)生耐藥性，使得臨床上對(duì)鴨疫里氏桿菌病的防控與治療造成一定的困難。該病已成為養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一[1]，一旦某地被檢測(cè)到鴨疫里氏桿菌病，很快將暴發(fā)為地方性疾病，且不容易根除。

鴨疫里氏桿菌最早由RIEMER 在患有流行性鵝滲出性敗血癥的病鵝中分離發(fā)現(xiàn)[2]。該菌為革蘭氏陰性菌，瑞士染色可見(jiàn)兩極濃染[3]，菌體呈桿狀或橢圓形，多為單個(gè)存在，無(wú)芽孢，無(wú)鞭膜，可形成莢膜。該菌屬于兼性厭氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分要求較高，因此，常使用含5%血清的TSA 固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。鴨疫里氏桿菌血清型多達(dá)21 種，臨床上多為不同血清型間的混合或交替感染[4]。鴨疫里氏桿菌不能使糖類發(fā)酵，常將此特性作為檢測(cè)該菌的重要指標(biāo)。盡管不同菌株之間生化特性存在差異，但僅通過(guò)生化指標(biāo)來(lái)鑒定鴨疫里氏桿菌是比較困難的[5]。而PCR 鑒定作為一種特異性強(qiáng)、易于操作的技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鴨疫里氏桿菌的鑒定。胡清海等[6]首次建立了應(yīng)用PCR 鑒定鴨疫里氏桿菌的方法體系，并設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)鑒定鴨疫里氏桿菌的不同血清型。

鴨疫里氏桿菌病一年四季都有發(fā)生，各種應(yīng)激都會(huì)促進(jìn)該病的發(fā)生，如飼養(yǎng)密度大、環(huán)境衛(wèi)生差、管理不當(dāng)?shù)?。該病主要?jīng)過(guò)呼吸道傳播，常呈現(xiàn)大量感染。在病程初期表現(xiàn)為精神沉郁、黃色下??；后期表現(xiàn)為行動(dòng)障礙，可見(jiàn)斜頸、轉(zhuǎn)圈等癥狀。剖檢可見(jiàn)明顯的纖維素性心包炎和肝周炎。該病的治療主要通過(guò)疫苗注射和使用抗菌藥物，但抗菌藥物在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的濫用不僅加快了鴨疫里氏桿菌耐藥性的產(chǎn)生，而且食品安全問(wèn)題也日益嚴(yán)重，故鴨疫里氏桿菌病的預(yù)防、控制和治療仍是當(dāng)前養(yǎng)鴨業(yè)的首要待解決問(wèn)題[7-8]。

本試驗(yàn)從廣東和山東地區(qū)的病鴨分離鑒定鴨疫里氏桿菌，采用Kirby-Bauer 紙片法對(duì)其進(jìn)行常見(jiàn)抗生素的耐藥性試驗(yàn)，旨在為當(dāng)?shù)伉喴呃锸蠗U菌病提供臨床用藥參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

臨床采集廣東和山東地區(qū)疑似鴨疫里氏桿菌病的組織樣品。

供試15 種藥物有林可霉素、慶大霉素、青霉素、大觀霉素、卡那霉素、阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、恩諾沙星、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考，均購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.2 試劑

胰酪胨大豆瓊脂（美國(guó)BD公司，貨號(hào)為CNL17-B0022）；胎牛血清FBS（杭州四季青生物有限公司，貨號(hào)為3011-8611）；瑞氏染色試劑盒（南京建成科技有限公司，貨號(hào)為D008-1-2）；革蘭氏染色試劑盒（南京建成科技有限公司，貨號(hào)為D010-1-2）；預(yù)混液Premix TaqTM、DNA Marker（索萊寶科技有限公司，貨號(hào)為M1070）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 采用無(wú)菌操作將采集病料研磨，并用無(wú)菌PBS 稀釋，將稀釋液用0.45 μm濾器過(guò)濾。用劃線法接種于含5%血清的TSA 固體培養(yǎng)基上，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，選擇疑似菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。傳代時(shí)培養(yǎng)皿中挑取肉眼可見(jiàn)半透明、圓形、微凸起的單菌落至含5%血清的TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中200 r/min 振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 染色鏡檢 挑取純化培養(yǎng)的單菌落于滴有PBS 的載玻片上進(jìn)行涂片，用革蘭氏、瑞氏染色試劑盒進(jìn)行染色。革蘭氏染色步驟按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。瑞氏染色方法：瑞士吉姆薩A 液涂片染色1 min；再將瑞士吉姆薩B 液滴加A 液上，染色3 min；沖洗、干燥。然后進(jìn)行顯微鏡鏡檢，觀察記錄菌落顏色與形態(tài)特征。

1.3.3 菌液PCR 檢測(cè)鑒定 挑取適量傳代培養(yǎng)單菌落作為基因擴(kuò)增模板，以鴨疫里氏桿菌ATCC 11845菌株作為參考菌株，DnaK基因作為保守基因，設(shè)計(jì)鑒定引物F：ATGGAGCAAGATTTATTCATTATTTGG GATAGATGCCTAC；R：TTATTTCTTATTTTCTCCTTC AATTCTTTTATGTACTTTC。用該引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增試驗(yàn)，PCR 反應(yīng)體系為：12 μL 預(yù)混液PremixTaqTM，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，1 μL cDNA 模板和10 μL 蒸餾水，總計(jì)25 μL。PCR 最佳熱循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃3 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 反應(yīng)后，通過(guò)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌液PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[9-10]，采用Kirby-Bauer紙片法，在無(wú)菌條件下將培養(yǎng)好的10 株菌液分別涂布在含5%血清的TSA 固體培養(yǎng)基上，涂布均勻。待稍微干燥后，用無(wú)菌鑷子將15 種藥物紙片平貼在培養(yǎng)基表面，間隔均勻，置于37 ℃條件下培養(yǎng)12 h 后觀察結(jié)果。判定藥敏抑菌結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)[11]為：抑菌環(huán)直徑20 mm 以上為極度敏感；15～20 mm 為高度敏感；10～15 mm 為中度敏感；在10 mm 以下為低度敏感；不出現(xiàn)抑菌環(huán)則為耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察

試驗(yàn)分離得到10 株菌株，在TSA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為半透明、光滑、濕潤(rùn)、中央稍有隆起的圓形菌落，直徑為0.5～1.0 mm。在5%CO2條件下培養(yǎng)約48 h 后可見(jiàn)透明露珠樣小菌落（圖1）。

2.2 染色鏡檢結(jié)果

由圖2 可知，革蘭染色后，可發(fā)現(xiàn)革蘭陰性的小短桿狀病原菌，多為單個(gè)菌分布或者成對(duì)散落，少量為鏈狀排列，無(wú)鞭毛和芽胞；瑞氏染色可見(jiàn)兩極濃染，符合鴨疫里氏桿菌的形態(tài)特征。

2.3 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)特定引物進(jìn)行特異性PCR 擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)清晰單一特定10 條目的條帶，確定其為鴨疫里氏桿菌（圖3）。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如表1 所示，通過(guò)抑菌環(huán)直徑對(duì)比，大部分菌株對(duì)林可霉素、慶大霉素、青霉素、大觀霉素、卡那霉素、阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其中，對(duì)β- 內(nèi)酰胺類（阿莫西林、青霉素、氨芐西林）、氨基糖苷類（慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、卡那霉素）和林可霉素類藥物（林可霉素）的耐藥率在50%以上，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）耐藥率較低，為10%；均對(duì)左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋鈉、四環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考高敏。

表1 鴨疫里氏桿菌分離株對(duì)不同藥物的耐藥性檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

鴨疫里氏桿菌病可在全世界內(nèi)廣泛流行[12]，嚴(yán)重阻礙了當(dāng)前養(yǎng)鴨業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。鴨疫里氏桿菌血清型較多，疫苗難以有效防治，使其成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要病原菌之一[13]。已知的鴨疫里氏桿菌至少有21 種血清型[8]，我國(guó)主要流行1 型、2 型、6 型和10 型[14]，在不同血清型之間其交叉免疫保護(hù)作用偏弱，再加上注射疫苗之后禽類產(chǎn)生免疫應(yīng)答的時(shí)間又比較長(zhǎng)，因此，長(zhǎng)期以來(lái)藥物防治一直是生產(chǎn)中控制該病的主要措施[15-16]。當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)中，越來(lái)越多的抗生素已被應(yīng)用于臨床治療中，且使用次數(shù)及使用量越來(lái)越多?？股氐氖褂秒m然短時(shí)間內(nèi)有所控制，但因雛鴨自身免疫力較低、疾病的傳染性較高，且飼養(yǎng)管理不當(dāng)使抗生素過(guò)度使用，加劇耐藥菌株的產(chǎn)生。相關(guān)研究表明[3，10]，鴨疫里氏桿菌對(duì)常用的阿莫西林、青霉素和慶大霉素等抗生素已經(jīng)產(chǎn)生單種耐藥性及多重耐藥性。本試驗(yàn)分離的10 株鴨疫里氏桿菌同樣對(duì)這3 種藥物產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性，其中8 株對(duì)阿莫西林產(chǎn)生耐藥性，6 株對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥性，5 株對(duì)慶大霉素產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)7 株對(duì)其表現(xiàn)多重耐藥性，由此可見(jiàn)，鴨疫里氏桿菌的耐藥性日趨嚴(yán)峻。

天然性耐藥和獲得性耐藥為細(xì)菌耐藥性的2 種形式，細(xì)菌呈現(xiàn)獲得性耐藥是因?yàn)槊舾行钥股囟啻吻议L(zhǎng)時(shí)間刺激該菌，進(jìn)而使其基因突變表現(xiàn)出相應(yīng)藥物的耐藥性。對(duì)鴨疫里氏桿菌的流行株進(jìn)行分離及體外藥敏試驗(yàn)的測(cè)定是確保藥物防治有效性的基礎(chǔ)檢測(cè)。SUN 等[12]對(duì)103 株鴨疫里氏桿菌完成了23 種常用抗菌藥物的耐藥性結(jié)果分析，其中68 株菌株表現(xiàn)多重耐藥性，即對(duì)2 種或2 種以上的抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥。ZHENG 等[17]完成了對(duì)分離到的里氏桿菌的耐藥菌株研究，結(jié)果表明，分離得到的菌株有40%以上對(duì)氯霉素表現(xiàn)出耐藥性，已呈現(xiàn)中度敏感，耐藥性趨勢(shì)增加。LUO 等[18]在CH-2株鴨疫里氏桿菌的全基因中找到了耐藥基因lnuH，該基因?yàn)橐环N新型的林可酰胺類抗性基因。XING 等[19]檢測(cè)了80 株鴨疫里氏桿菌對(duì)藥物的耐藥性情況，結(jié)果檢測(cè)到對(duì)紅霉素耐藥性菌株43 株（53.75%），通過(guò)基因分析，其分別攜帶ermF、ermFU或ereD紅霉素耐藥基因。上述報(bào)道的菌株耐藥性與本試驗(yàn)結(jié)果存在較大差異，這是由于各個(gè)地區(qū)用藥習(xí)慣不同而抗藥性不同所致。吳彩艷等[20]對(duì)前幾年廣東地鴨疫里氏桿菌的耐藥性檢測(cè)表明，其對(duì)頭孢類、氟苯尼考、阿莫西林藥物敏感。本研究分離菌株對(duì)頭孢類、氟苯尼考高敏，但已經(jīng)對(duì)阿莫西林完全耐藥。

本試驗(yàn)分離鑒定的10 株鴨疫里氏桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類（阿莫西林、青霉素、氨芐西林）、氨基糖苷類（慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、卡那霉素）、林可霉素類藥物（林可霉素）的耐藥性在50%以上，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）耐藥率較低，為10%，但對(duì)喹諾酮類（左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星）、四環(huán)素類（四環(huán)素）、氯霉素類藥物（氟苯尼考）和頭孢噻呋鈉高敏。本研究對(duì)當(dāng)?shù)伉喴呃锸蠗U菌病的用藥預(yù)防與臨床治療提供了參考。