劉芝芝，樊俊苗，王銀柱，高建華，杜 方

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京210095；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

百合（Liliumspp.）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的球根花卉[1]。目前，百合屬約有120 個種，還有很多人工雜交產(chǎn)生的新品種[2]?；ㄏ闶前俸现匾挠^賞性狀之一。不同種類百合香味不同，如東方百合香味濃郁，而亞洲百合香氣微弱[3]。香氣改良是百合育種的重要目標(biāo)之一。

百合主要釋香部位是花被片，單萜類化合物是百合花香物質(zhì)的主成分之一。從花被片中釋放的萜類物質(zhì)成分和含量因品種不同，差異較大[4-6]。萜類物質(zhì)的合成受甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）和甲基赤蘚糖醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑多種酶的調(diào)控，其中，萜烯合酶（terpene synthase，TPS）是MVA 和MEP 途徑中催化最后一步反應(yīng)的酶。TPS基因在濃香型百合中的表達(dá)水平顯著高于無香或淡香型中的表達(dá)水平[3-4，7-8]。王婷等[5]已從41 個百合品種（含Sorbonne）中鑒定出46 種香氣成分，并對其進(jìn)行香型分類[9]；同時(shí)，樊俊苗[10]從濃香Sorbonne 中克隆出3 個單萜合成酶基因（LsoTPS-1、LsoTPS-2、LsoTPS-3），從無香Red Life中克隆出2 個基因（LrlTPS-1、LrlTPS-3），并揭示了其核酸的多態(tài)性。但是對Sorbonne 和Red Life 香氣差異及其TPS 蛋白結(jié)構(gòu)和功能未深入研究。

本研究通過氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對2 個百合品種揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，旨在研究濃香與無香百合香氣成分差異；同時(shí)對2 個品種中TPS 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而揭示二者單萜合成酶在蛋白水平上的差異，為之后TPS 蛋白功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 2016 年，Sorbonne 試驗(yàn)材料來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站露地百合資源圃，在晴朗天氣下采集生長健壯植株盛花期的花被片用于香氣測定；2017 年，Sorbonne 來自山西省晉中市太谷縣切花市場，在3 枝切花中各取1 朵正處于盛花期的花作為供試材料，重復(fù)3 次；2018 年，Sorbonne 來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站溫室內(nèi)，選擇正處于盛花期、長勢一致且健壯植株3 株，在晴朗天氣的8：00—10：00 每株各采1 朵花組成1 個樣品，重復(fù)測定3 次。2020 年，Red Life 材料來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站露地百合資源圃，供試材料選擇與制樣同2018 年Sorbonne。Sorbonne 和Red Life 的相關(guān)信息如表1 所示。

表1 Sorbonne 和Red Life 相關(guān)信息

1.1.2 儀器 Trace ISQ 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fishe 公司）；DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱（美國ThermoFishe 公司）；50/30 μm PDMS/DVB/CAR萃取頭和進(jìn)樣器（美國Supelco公司）。

1.2 方法

1.2.1 香氣采集及GC-MS 分析 稱取花被片約1.5 g 置于20 mL 頂空固相微萃取專用頂空瓶中，利用頂空進(jìn)樣器提取香氣成分并完成進(jìn)樣，對百合揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行GC-MS 分析。

氣相色譜條件：DB-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；流速1 mL/min，He 為載氣；程序升溫：起始柱溫40 ℃，保持2 min，之后以5 ℃/min速率升溫至270 ℃，持續(xù)6 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI；電離電壓70 eV；質(zhì)譜掃描范圍45～600 amu；離子源溫度280 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃。

利用Thermo Xcalibur 軟件系統(tǒng)自帶的NIST 標(biāo)準(zhǔn)庫檢索各組分，參考文獻(xiàn)[3，5，9]進(jìn)一步篩選，綜合考慮最終確定Sorbonne 和Red Life 中的揮發(fā)性物質(zhì)。利用峰面積歸一化法，計(jì)算各組分相對含量。

1.2.2 百合TPS 蛋白生物信息學(xué)分析 依據(jù)各類生物信息學(xué)工具（表2）在線比對分析LsoTPS-1、LsoTPS-2、LsoTPS-3、LrlTPS-1 和LrlTPS-3 這5 個TPS 蛋白的氨基酸序列并預(yù)測其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、信號肽和蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)，以此揭示有香和無香百合中TPS 蛋白間的差異，為原核表達(dá)載體構(gòu)建和體外蛋白表達(dá)解析提供依據(jù)。

表2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的分析軟件和網(wǎng)站

2 結(jié)果與分析

2.1 Sorbonne 和Red Life 香氣物質(zhì)及差異分析

從表3 可以看出，2016 年Sorbonne 中共檢測出18 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中，主要揮發(fā)性物質(zhì)是（E）-β- 羅勒烯，其次是苯甲酸甲酯。2017 年Sorbonne中共檢測出25 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要揮發(fā)性物質(zhì)也是（E）-β- 羅勒烯和苯甲酸甲酯，較2016 年多檢測出11 種揮發(fā)性物質(zhì)，相對含量均小于3.53%，整體偏低，但也有4 種揮發(fā)性物質(zhì)未檢測到，這可能是2016 年試驗(yàn)未做重復(fù)，試驗(yàn)誤差偏大造成的。2018 年Sorbonne 中共檢測出28 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要揮發(fā)性物質(zhì)仍是（E）-β- 羅勒烯，其次是苯甲酸甲酯；此外，也檢測出新?lián)]發(fā)性物質(zhì)（前2 a 未檢測出的物質(zhì)）10 種，相對含量為0～11.19%，但也有11 種揮發(fā)性物質(zhì)未檢測到，這可能是不同栽培環(huán)境影響了其揮發(fā)性物質(zhì)的釋放。

表3 Sorbonne 和Red Life 揮發(fā)性物質(zhì)種類和相對含量差異

綜合分析Sorbonne 在3 a 的GC-MS 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，（E）-β- 羅勒烯和苯甲酸甲酯是其主要揮發(fā)性物質(zhì)，其中，（E）-β- 羅勒烯相對含量更高，約超過32.00%。同時(shí)，Sorbonne 在3 a 里都還檢測到另外3 種單萜（E，Z）- 別羅勒烯、波斯菊烯、芳樟醇；1 種不規(guī)則萜6- 甲基-5- 庚烯-2- 酮；2 種倍半萜α- 法尼烯、α- 柏木烯；另外2 種苯類物質(zhì)苯甲酸乙酯、苯甲酸芐酯；1 種脂肪酸衍生物惕各酸甲酯。此外，有18 種揮發(fā)性物質(zhì)只在其中1 a 中檢測到，相對含量在0～11.19%；有10 種在其中2 a 里檢測出，相對含量在0～7.23%，這可能由于它們來自不同生長環(huán)境引起的。總之，不管Sorbonne 中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量如何變化，其主要揮發(fā)性物質(zhì)均是（E）-β- 羅勒烯和苯甲酸甲酯。

由表3 可知，Red Life 中共檢測出23 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中，鑒定出單萜4 種，倍半萜3 種，苯類物質(zhì)3 種，苯丙烷類物質(zhì)1 種，脂肪酸衍生物12 種。其相對含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)是D- 檸檬烯（26.25%），其次是2- 甲基丁酸甲酯（19.97%），之后是丁酸甲酯（10.77%），而其他揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量均不超過8.02%。

綜合表明，Sorbonne 中揮發(fā)性物質(zhì)種類較Red Life 更加豐富，且揮發(fā)性物質(zhì)含量也較Red Life 更高。Sorbonne 中的主要揮發(fā)性物質(zhì)是（E）-β- 羅勒烯和苯甲酸甲酯，且單萜類物質(zhì)的相對含量比苯類物質(zhì)整體偏高；Red Life 中盡管D- 檸檬烯的相對含量最高，但其單萜種類和含量都整體偏低，且Red Life 中不含Sorbonne 中擁有的（E）-β- 羅勒烯、（E，Z）- 別羅勒烯、月桂烯、波斯菊烯、（-）-Alpha- 胡椒烯和β- 蒎烯，其揮發(fā)性物質(zhì)多為脂肪酸衍生物。由此推測，單萜類物質(zhì)很可能是引起Sorbonne 和Red Life 香氣差異的主要原因之一。

2.2 百合TPS 蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 TPS 蛋白氨基酸序列及理化性質(zhì)分析 5 個TPS可以分為3 類，LsoTPS-1和LrlTPS-1的編碼區(qū)全長1 761 bp，編碼586 個氨基酸；LsoTPS-2的編碼區(qū)全長1 773 bp，編碼590 個氨基酸；LsoTPS-3和LrlTPS-3的編碼區(qū)全長1 647 bp，編碼548 個氨基酸。DNAMAN 軟件氨基酸序列比對結(jié)果表明，相較于LsoTPS-1 和LrlTPS-1 蛋白，LsoTPS-3 和LrlTPS-3缺失了38 個氨基酸，LsoTPS-2 插入了4個氨基酸（圖1）。

不同品種中同一類TPS 存在氨基酸突變，LsoTPS-1 與LrlTPS-1 第316 位置的氨基酸不同，由纈氨酸（Val）變?yōu)楸彼幔ˋla），都屬于脂肪族類氨基酸；LsoTPS-3 與LrlTPS-3 有3 個氨基酸不同，第80 位置的亮氨酸（Leu）變?yōu)楦彼幔≒ro），前者屬于脂肪族類氨基酸，后者屬于亞氨基酸；第230 位置的組氨酸（His）變?yōu)榫彼幔ˋrg），都屬于堿性氨基酸；第531 位置的異亮氨酸（IIe）變?yōu)榈鞍彼幔∕et），即由脂肪族類氨基酸變?yōu)楹蝾惏被幔▓D1）。

使用ProtParam 分析5 個TPS 蛋白氨基酸理化性質(zhì)，結(jié)果顯示（表4），5 個TPS 蛋白分子質(zhì)量均在65 ku 左右，理論等電點(diǎn)介于5.50～6.00，負(fù)電荷殘基Asp＋Glu 數(shù)目都大于正電荷殘基Arg＋Lys，推測為酸性蛋白；LrlTPS-3 蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為40.78（不穩(wěn)定系數(shù)＜40 時(shí)穩(wěn)定），穩(wěn)定性較差，其余蛋白不穩(wěn)定系數(shù)都小于40，均為穩(wěn)定蛋白；5 個TPS 蛋白總平均疏水值小于0，均具有親水性。綜上可知，5 個TPS 蛋白既是酸性蛋白，又是親水蛋白，除LrlTPS-3 蛋白外，其余都是穩(wěn)定蛋白。

表4 不同TPS 蛋白一級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.2 TPS 蛋白信號肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用SignalP3.0 預(yù)測5 個TPS 氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)這幾種蛋白均不存在信號肽，推測為非分泌蛋白質(zhì)，無需在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成。運(yùn)用TargetP1.1 Server 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，5 個TPS 蛋白均可能具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中，LsoTPS-2 可靠級別3 級，其余可靠級別2 級（表5）。經(jīng)ChloroP1.1 Server 分析發(fā)現(xiàn)，同一品種中不同類TPS 的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽長度不一樣，但不同品種中同一類TPS 葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的長度相 同，LsoTPS-1 和LrlTPS-1、LsoTPS-2、LsoTPS-3和LrlTPS-3 蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽分別有31、41、15個氨基酸殘基（表5）。由此推測，TPS 蛋白在游離核糖體上合成后，直接運(yùn)輸?shù)饺~綠體中行使功能。

表5 不同TPS 氨基酸序列亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.2.3 TPS 蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過SPOMA預(yù)測5 個TPS 氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，這5 個蛋白以α- 螺旋（65.69%～67.92%）為主，β- 折疊僅占3.5%（表6）。由于5 個蛋白與數(shù)據(jù)庫中（+）- 檸檬烯合酶的同源性均高于40%，因此，可使用SWISSMODEL軟件進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)同源建模。結(jié)果顯示，5 個蛋白具有豐富的α- 螺旋，且由2 個結(jié)構(gòu)域組成，它們之間的重要差異主要在2 個結(jié)構(gòu)域的連接處（圖2）。

表6 百合TPS 蛋白二級結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成組件比例分析

3 結(jié)論與討論

花香通常被稱為“花的靈魂”，是揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）賦予觀賞植物的一個重要品質(zhì)指標(biāo)[11]。組成花香的VOCs 根據(jù)其代謝來源可分為三大類：萜烯類化合物、苯類/苯丙烷類化合物和脂肪酸衍生物[12]，其中，萜類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物中最大且結(jié)構(gòu)最多樣的一類[13-15]。在濃香百合中萜類化合物就占了極大的比例，尤其是（E）-β- 羅勒烯、桉樹腦等多種單萜類物質(zhì)[16]。張輝秀等[8]和唐彪等[3]的研究也指出，濃香的東方和麝香百合中單萜類物質(zhì)釋放量高，而淡香的亞洲和麝亞百合中香氣成分主要是烷烴類物質(zhì)，且未檢測到萜烯類物質(zhì)。此外，相關(guān)學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，百合香氣成分的釋放量會隨花期先增大后減小，盛花期達(dá)到最大，也會隨日照出現(xiàn)從早到晚先增加后減少的變化[2，17]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sorbonne 中的主要揮發(fā)性物質(zhì)是（E）-β- 羅勒烯和苯甲酸甲酯，不會隨年份發(fā)生改變，其中，（E）-β- 羅勒烯相對含量更高；但Red Life 中單萜類物質(zhì)種類和含量都整體偏低。范燕萍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，東方百合西伯利亞特征香氣成分是苯甲酸乙酯，亞洲百合精粹的揮發(fā)性物質(zhì)含量很少，無香?？梢?，不同有香百合品種的主要芳香成分不同，且不同無香品種的揮發(fā)性物質(zhì)釋放量都偏低，從而導(dǎo)致其無香。

單萜類化合物是百合花致香的關(guān)鍵成分[18]，一般是通過MEP 途徑在TPS 的催化下合成的，TPS是MEP 生物合成途徑最后一步的酶[13]。TPS 的種類和功能決定了萜烯類物質(zhì)的多樣性，因此，對TPS結(jié)構(gòu)和特性的解析是利用其進(jìn)行生物反應(yīng)器生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的重要基礎(chǔ)，也為揭示有香和無香百合中萜烯類物質(zhì)在蛋白水平上的差異提供了理論依據(jù)。

Sorbonne 中的LsoTPS-1、LsoTPS-2 和LsoTPS-3 與Red Life 中的LrlTPS-1 和LrlTPS-3 這5 個蛋白之間存在氨基酸差異位點(diǎn)，它們的三級結(jié)構(gòu)也具有不同之處。上述差異很可能會影響它們的蛋白功能。孫靜[19]研究發(fā)現(xiàn)，秋菊神馬和夏菊優(yōu)香中的CmFTLps1、CmFTLps2、CmFTLps3 和CmFTLps4，這4 個轉(zhuǎn)錄本在序列上存在18 個氨基酸位點(diǎn)的差異，而且在空間構(gòu)象上也存在差異，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化研究后發(fā)現(xiàn)，除CmFTLps4 外其余均能回補(bǔ)其晚花表型，由此推測，CmFTLps4 功能缺失與4 個氨基酸差異位點(diǎn)有關(guān)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，5 個TPS 蛋白不具信號肽，但很可能具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。ABBAS等[20]和ZHANG 等[11]通過亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證明，百合Siberia 中的LoTPS1、LoTPS3 和LiTPS2 分別存在于質(zhì)體、線粒體和葉綠體中。

本研究使用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測了濃香Sorbonne和無香Red Life 中的揮發(fā)性物質(zhì)，揭示二者香氣成分差異，并利用生物信息學(xué)方法比較了Sorbonne 和Red Life 中5 個TPS 蛋白之間的差異，從分子水平進(jìn)一步揭示二者花香差異原因，為之后研究TPS 蛋白功能奠定基礎(chǔ)。