程 浩，孟運生，劉 輝，周 磊，師留印，張靜敏

(核工業(yè)北京化工冶金研究院，北京 101149)

中國火山巖型鈾礦石儲量較大，約占全國總儲量的20%以上，其中相當部分為鈾鉬礦、鈾鉬金銀礦[1]，開發(fā)利用這類鈾礦資源具有很強的現實意義。在鈾鉬共生礦中，鈾礦物以瀝青鈾礦為主；鉬礦物以輝鉬礦、膠硫鉬礦為主。

近年來鉬及其化合物的應用領域不斷拓寬，鉬的需求量不斷上升，鉬的濕法浸出研究也倍受重視。具有工業(yè)價值的鉬礦物主要是輝鉬礦(MoS2)，它占國內外開采鉬量的98%左右。輝鉬礦型鈾礦屬于難浸礦石，常規(guī)浸出方法是將礦石破磨到-250 μm(-60目)后，加入氧化劑進行酸浸或高壓堿浸，其工藝流程復雜，試劑消耗量大，生產成本高。

近年來微生物濕法冶金技術在加工稀貴金屬的硫化物礦石上取得了較大進展，硫化銅礦細菌浸出技術、難處理金礦的細菌氧化預處理技術等在國內外都已產業(yè)化[2]，鈾礦細菌浸出在國外也已經實現工業(yè)化應用[3]。核化冶院經過多年的研究，也于2002年首次實現鈾礦細菌堆浸工業(yè)化[4]。對于難浸的鈾鉬共生礦，尚未見細菌浸出方面的研究報道，對于輝鉬礦細菌浸出工藝研究也相對較少。

采用細菌浸出工藝處理輝鉬礦是依靠細菌的作用，完成對金屬硫化礦的氧化，解除硫化礦物對鈾、鉬等有價金屬的包裹，打通基質粒間、微裂隙通道，方便浸出劑的進入和浸出液的滲出，從而提高鈾、鉬、銅、鋅、鎳等有價金屬的浸出率，提高資源利用率[5]。采用氧化亞鐵硫桿菌(T.f)來氧化輝鉬礦(MoS2)是可行的[6]；但現有菌種對輝鉬礦(MoS2)氧化效率低，對Mo的耐受性能低[7]，從而導致浸出時間長，鉬浸出率低。因此進行新菌株耐鉬選育的研究，對優(yōu)化鉬礦細菌浸出過程，降低生產成本，提高資源綜合回收利用率都具有重要的意義。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：PHS-3B型精密pH計(上海精密科學儀器有限公司)；生物顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；真空泵(沈陽市真空泵廠)；微孔濾膜(北京黎明膜分離技術有限責任公司)；WFZUV-2000型分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)；BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；OLYMPUS BX51型系統顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；溫度梯度PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；凝膠成像系統(英國Syngene公司)；紫外投射反射分析儀(上?？等A生化儀器制造廠)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；三角瓶、燒杯、試管、培養(yǎng)皿(博美玻璃儀器廠)。

主要試劑包括硫酸、硫酸亞鐵、氯化鈉、瓊脂粉、硫酸銨、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，均為國產分析純試劑。

1.2 試驗菌種

試驗菌種包括原氧化亞鐵硫桿菌、氧化亞鐵鉤端螺旋菌和野生菌LM1。

氧化亞鐵硫桿菌為革蘭氏陰性無機化能自養(yǎng)菌。該菌好氧嗜酸，以Fe2+和還原態(tài)硫為能源物質，可以氧化Fe2+、元素硫及幾乎所有的硫化礦物，能有效分解黃鐵礦。它以空氣中的CO2為碳源，吸收N、P、K等無機營養(yǎng)，合成菌體細胞，在金屬硫化礦或煤礦的酸性礦坑水中較為常見。該菌形狀呈圓端短柄狀，細胞直徑約0.5～0.8 μm，長度約1.0～1.5 μm，端生鞭毛，能運動；適宜生長pH為1～4(最佳生長pH為1.8～2.5)，存活溫度為2～40 ℃(最佳存活溫度為30～35 ℃)。

氧化亞鐵鉤端螺旋菌(L.f)購于美國標準菌種收藏所(ATCC)，該菌為專性好氧、無機化能自養(yǎng)菌。它以鐵和黃鐵礦為能源物質，呈螺旋狀，細胞直徑約0.2～0.4 μm，長度約0.9～1.1 μm，典型革蘭氏陰性菌，單鞭毛，可動；適宜生長pH為1.5～4.0(最佳生長pH為1.8～2.5)，存活溫度為5～40 ℃(最佳存活溫度為28～32 ℃)。

野生菌LM1是從河南欒川鉬礦的礦坑水中分離純化而來。使用富集培養(yǎng)基對該礦坑水樣品進行富集培養(yǎng)，將培養(yǎng)得到的野生菌通過涂布法接種到固體培養(yǎng)基中，再從固體培養(yǎng)基產生的單獨菌落中挑取細菌接種至液體9K培養(yǎng)基中培養(yǎng)；如此往復進行，通過固液交替培養(yǎng)方法純化得到菌株LM1。

1.3 培養(yǎng)基配方

液體9K培養(yǎng)基：在1 000 mL蒸餾水中加入3.0 g (NH4)2SO4、0.5 g K2HPO4、0.1 g KCl、1.0 g MgSO4·7H2O、44.4 g FeSO4·7H2O，混合均勻，并在121 ℃下滅菌20 min。液體9K培養(yǎng)基的pH=2.0。

固體培養(yǎng)基：在1 000 mL蒸餾水中加入5.0 g (NH4)2SO4、0.15 g KCl、0.75 g MgSO4·7H2O、2.0 g FeSO4·7H2O、10 g瓊脂，混合均勻，并在115 ℃下滅菌30 min。固體培養(yǎng)基的pH=4.6～4.8。

富集培養(yǎng)基：2倍濃度的液體9K培養(yǎng)基。

1.4 細菌耐鉬馴化試驗方法

細菌浸礦技術中常用的無機化能自養(yǎng)菌的選育技術有馴化育種和遺傳選育[8]。馴化育種是在人為逐漸改變外界環(huán)境條件的情況下，對細菌進行轉移培養(yǎng)，通過細菌本身優(yōu)勝劣汰的過程演變，使那些活性較強并逐漸發(fā)生變異的細菌存活下來，最終培育出適應性、耐受性較強的新菌株[9]。

本研究采用的馴化方法為濃度梯度馴化法，即在菌株轉移培養(yǎng)的過程中逐步提高培養(yǎng)基中的鉬濃度，篩選出耐受性強的菌株，從而達到對試驗菌鉬耐受性馴化的目的。

1.4.1 氧化亞鐵硫桿菌耐鉬馴化

往9K培養(yǎng)基中加入鉬酸銨，在pH 1.7～2.2、溫度28～35 ℃(用加熱棒控制溫度)條件下鼓氣培養(yǎng)，監(jiān)測培養(yǎng)物氧化還原電位大于500 mV時，將一半菌液用微孔濾膜(孔徑為0.22 μm)過濾。過濾后細菌截留在濾膜上，用蒸餾水將其沖洗入剩余培養(yǎng)基中，補充9K培養(yǎng)基和鉬酸銨，提高培養(yǎng)基中的鉬濃度，繼續(xù)馴化培養(yǎng)。不斷重復上述操作，逐步提高細菌對鉬的耐受能力。

1.4.2L.f菌和野生菌耐鉬馴化

在500 mL的三角瓶中加入9K培養(yǎng)基再加入鉬酸銨，控制ρ(Mo)由低到高逐漸增加進行馴化培養(yǎng)，首先在ρ(Mo)為100 mg/L的9K培養(yǎng)基中接種20%(體積分數)的菌種，在生物培養(yǎng)箱中鼓氣培養(yǎng)(30 ℃，150 r/min)；當培養(yǎng)基中的電位大于500 mV時，作為新的菌種再接種到ρ(Mo)更高的9K培養(yǎng)基中，再次馴化培養(yǎng)，接種量一般為培養(yǎng)基體積的10%。這樣依次不斷增加ρ(Mo)進行耐鉬馴化。

2 馴化試驗結果與討論

2.1 氧化亞鐵硫桿菌馴化結果

經過一年馴化，氧化亞鐵硫桿菌耐鉬濃度達到550 mg/L；次年繼續(xù)對其進行馴化，試驗結果見表1。

表1 氧化亞鐵硫桿菌耐鉬馴化試驗結果

經過342 d的馴化，氧化亞鐵硫桿菌的耐鉬質量濃度從560 mg/L升高到了820 mg/L。由于鉬對氧化亞鐵硫桿菌有較強的毒害作用，在馴化培養(yǎng)過程中，一定要注意鉬濃度的增長梯度。本馴化試驗鉬質量濃度每次增長10～20 mg/L，每個濃度重復馴化2～3次，使細菌充分適應溶液環(huán)境；隨著重復馴化次數的增加，細菌的培養(yǎng)時間相應縮短。

2.2 L.f菌和野生菌的耐鉬馴化結果

經過多次轉接馴化，氧化亞鐵鉤端螺旋菌和野生菌株LM1的耐鉬濃度均得到提高，耐鉬馴化結果見表2～3。

表2 L.f菌耐鉬馴化試驗結果

表3 野生菌株LM1耐鉬馴化試驗結果

由表2～3可看出，L.f菌經過145 d馴化，其耐受鉬濃度從100 mg/L升高到了620 mg/L；野生菌株LM1經過148 d馴化，其耐受鉬濃度從100 mg/L升高到了580 mg/L。而氧化亞鐵硫桿菌經過一年馴化耐受鉬濃度達到550 mg/L，這表明L.f菌和野生菌株LM1對耐鉬馴化的適應性強于氧化亞鐵硫桿菌。試驗表明，當某一濃度下馴化周期較長時，可通過在同一濃度梯度下反復馴化或降低濃度梯度的方法縮短馴化周期。

3 野生菌株的生理生化特性研究及分子生物學鑒定

3.1 菌落及菌體形態(tài)

菌株LM1在固體培養(yǎng)基平板上菌落較小，呈半透明，圓形，中間凸起，直徑約15～20 μm(圖1)。光學顯微鏡下觀察LM1菌體，可見菌體較小，桿狀，能運動；革蘭氏染色陰性，菌體呈紅色(圖2)。在透射電子顯微鏡下觀察菌體，可見有單根鞭毛，近端生，細胞直徑約0.4～0.6 μm，長度約2～2.5 μm(圖3)。

圖1 LM1菌落形態(tài)

圖2 LM1革蘭氏染色結果

圖3 LM1透射電鏡照片

3.2 LM1生長曲線

按培養(yǎng)基體積10%的量接種菌株于滅菌9K培養(yǎng)基中，在28 ℃搖床恒溫培養(yǎng)，做3組平行試驗，在培養(yǎng)一定時間后取樣測OD420(420 nm波長下樣品吸光度)，用未接種的9K培養(yǎng)基作為對照。LM1生長曲線如圖4所示?？梢钥闯觯琇M1在28 ℃下搖床培養(yǎng)，在20～30 h快速生長，30 h后達到穩(wěn)定期。

圖4 LM1生長曲線

3.3 LM1最適培養(yǎng)條件

3.3.1 LM1生長溫度

按培養(yǎng)基體積10%的量接種純化菌株于滅菌9K培養(yǎng)基中，在搖床中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別是25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃，每個溫度做5組平行試驗，48 h后測OD420，用未接種的9K培養(yǎng)基作為對照。LM1生長溫度曲線如圖5所示?？梢钥闯觯?0 ℃為LM1最適生長溫度，低于30 ℃的培養(yǎng)溫度對LM1生長顯著抑制；高于30 ℃的培養(yǎng)溫度，菌體生長也受到抑制。

圖5 LM1生長溫度曲線

3.3.2 LM1生長pH

按培養(yǎng)基體積10%的量接種菌株于滅菌9K培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH分別是0.0、1.0、2.0、3.0，每個pH條件做5組平行試驗，48 h后測OD420，用未接種的9K培養(yǎng)基作為對照。LM1生長pH曲線如圖6所示?？梢钥闯?，LM1最適生長pH為2.0～2.5；pH<1，菌體不生長；pH>2.5，菌體生長受到抑制。

圖6 LM1生長pH曲線

3.3.3 LM1能源利用情況

在不含Fe2+的100 mL 9K液體培養(yǎng)基中分別加入1%的單質硫、4.31%的FeSO4·7H2O、4.31%的FeSO4·7H2O+1%的單質硫、1%的Na2S2O3·5H2O；其中Na2S2O3·5H2O、FeSO4·7H2O均采用0.22 μm超濾膜過濾除菌后再加入培養(yǎng)基，單質硫隔水蒸煮1 h后再加入培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基體積1%的量接種，30 ℃下搖床培養(yǎng)3 d后測OD420，用各組未接種的培養(yǎng)基作為對照。LM1能源利用情況如圖7所示?？梢钥闯?，LM1不能以Na2S2O3為唯一能源生長，在以S為唯一能源時生長微弱，在含Fe2+的培養(yǎng)基中生長旺盛。

圖7 LM1能源利用情況

3.4 LM1菌株16S rDNA鑒定

采用TianGen細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA。PCR擴增采用細菌16S rDNA通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1541r (5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)。PCR反應體系(50 μL)組成：MgCl2(1.5 mmol/L)、基因組DNA (10 ng)、dNTP (200 μmol/L)、引物(0.4 μmol/L)和Taq DNA聚合酶(1.25 U)。PCR反應條件：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)。PCR產物純化后連接到pMD18-T載體上，轉化E.coli DH5α。

PCR擴增獲得了LM1的16S rDNA核苷酸片斷，大小為1 526 bp，并獲得其核苷酸序列。重組質粒由上海生工完成測序，將所得16S rDNA序列在http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行N Blast，選出相似性大于98%的部分序列，進行系統進化樹分析[10]。通過序列相似性比對和進化樹關系比對，可得出該菌為氧化亞鐵硫桿菌(AcidithiobacillusferrooxidansLM1)。

4 結論

通過馴化可以有效提高細菌對鉬的耐受能力，其馴化速度與菌株本身性質有關。當馴化周期較長時，可通過在同一濃度梯度下重復馴化或降低濃度梯度的方式縮短馴化周期。氧化亞鐵硫桿菌通過365 d馴化，其耐受鉬質量濃度達到550 mg/L；經過707 d的馴化，其耐鉬質量濃度達到了820 mg/L。氧化亞鐵鉤端螺旋菌通過145 d馴化，其耐受鉬質量濃度達到620 mg/L。野生菌株LM1通過148 d馴化，其耐受鉬質量濃度達到580 mg/L。

野生菌LM1在28 ℃下的生長周期為30 h，最適生長溫度為30℃，最適生長pH為2.0～2.5，不能以Na2S2O3為唯一能源生長，在以S為唯一能源時生長微弱，在含Fe2+的培養(yǎng)基中生長旺盛。野生菌LM1為革蘭氏陰性菌，菌體桿狀，近端生鞭毛，能運動；固體培養(yǎng)基上生長菌落小，半透明，圓形，中間凸起；分子生物學鑒定結果表明該菌株為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(AcidithiobacillusferrooxidansLM1)。