張藍予，秦春妮，梁 影，陳書弘，黑飛龍

急性肺損傷發(fā)生率較高，感染、創(chuàng)傷、機械通氣及體外循環(huán)等均可導致急性肺損傷［1－3］，中重度肺損傷的死亡率超過40%［4］，新冠肺炎所致重度肺損傷為致死的重要因素之一。 然而肺損傷的發(fā)病機制仍不十分明確。

細胞外囊泡是細胞間的溝通橋梁，包括凋亡小體，微囊泡（microvesicles， MVs）及外泌體，其在機體中的作用得到越來越廣泛的關注。 新近研究表明肺損傷期間肺泡灌洗液中含有大量胞外囊泡［5］。 在肺損傷早期，巨噬細胞來源的胞外囊泡占據(jù)60%［5］。 而其中，MVs 為巨噬細胞產生的主要胞外囊泡類型［5－6］。 但MVs 對肺損傷的作用及機制仍待研究。 因而本項研究擬通過獲取肺泡巨噬細胞來源的MVs 探究其對肺損傷的作用及潛在機制，擬為肺損傷提供基于胞外囊泡治療新方向的參考。

1 材料與方法

1.1 肺泡巨噬細胞的培養(yǎng) 小鼠肺泡巨噬細胞系（mouse alveolar macrophage cell， MHS）（ATCC 公司），經RPMI－1640 培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（Gibico，美國）及1%雙抗于T225 培養(yǎng)瓶（Corning，美國）中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件：37℃，5% CO2。 待細胞量長至108，更換為去除囊泡的完全培養(yǎng)基并給予脂多糖（Lipopolysaccha?rides，LPS，Sigma Aldrich，美國）100 μg／L 或等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）刺激1 h。

1.2 提取肺泡巨噬細胞來源的MVs［6］收集刺激后的細胞上清，放入離心機（賽默飛，美國），300 g 4℃離心10 min 后，棄沉淀，上清液再次2 000 g 4℃離心20 min，棄沉淀，上清移入高速離心管中，放入高速離心機（貝克曼，美國）繼續(xù)20 000 g 4℃離心30 min，離心后棄上清，PBS 重懸沉淀于20 000 g 4℃再次離心30 min，重復一次PBS 清洗，最終沉淀于PBS 重懸保存。

1.3 肺泡巨噬細胞來源的MVs 的鑒定 采用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM） 觀察MVs 形態(tài)，納米粒徑追蹤技術（nanoparticle tracking analysis，NTA）觀測MVs 數(shù)量及粒徑分布。

1.4 實驗分組及處理 將C57／BL6 小鼠隨機分為三組：①PBS 組（PBS 氣管內刺激，劑量為50 μl，n ＝4）；②Control－MV 組（PBS 刺激的肺泡巨噬細胞來源的MVs 經氣管內刺激小鼠，劑量為50 μg／50 μl，n ＝4）；③LPS－MV 組（LPS 刺激的肺泡巨噬細胞來源的MVs 經氣管內刺激小鼠，劑量為50 μg／50 μl，n ＝4）。 分別作用4 h 后獲取小鼠肺組織。

1.5 肺損傷評估 評分內容為肺間質水腫、肺泡水腫、肺泡充血、中性粒細胞浸潤，病變程度為：0 分－無病變或極輕度病變；1 分－輕度病變；2 分－中度病變；3 分－重度病變；4 分－極重度病變。

1.6 蛋白免疫印跡 提取MVs 蛋白和肺組織蛋白后，行聚丙酰胺凝膠電泳，后將蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶（TBST 配制），封閉1 h，TBST 清洗3 次后孵育一抗4℃過夜：CD68（1 ∶800），CD63（1 ∶800） 及ALIX（1 ∶1 000），閉合小環(huán)蛋白（ZO－1，1 ∶800），咬合蛋白（Occludin，1 ∶1 000），閉合蛋白（Claudin－5，1 ∶800），內參（GAPDH，1 ∶1 000）；TBST 清洗PVDF 膜三次后，孵育二抗90 min；TBST清洗后進行電化學發(fā)光法顯影，采用image J 對各蛋白進行含量分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0 軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bon?ferroni 事后檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 肺泡巨噬細胞來源的MVs 提取與鑒定 經梯度離心獲取MVs，TEM 鑒定MVs 形態(tài)（圖1），NTA 發(fā)現(xiàn)MVs 粒徑峰值集中于100～200 nm（圖1），蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)MVs 表達CD63、CD68 及ALIX（圖2）。

2.2 肺泡巨噬細胞來源的MVs 致小鼠肺損傷 HE染色顯示，與PBS 組及Control－MV 組相比，LPSMVs 刺激的肺組織呈現(xiàn)明顯間質水腫及炎性細胞浸潤，且肺損傷評分更高（P＜0.05，n ＝4，圖3）。

圖1 巨噬細胞來源的MVs 的鑒定

圖2 巨噬細胞來源的MVs 表面標志物表達

圖3 巨噬細胞來源MVs 對肺損傷的作用

2.3 肺部連接蛋白（tight junction， TJ）的表達 蛋白免疫印跡結果表明，相比PBS 組及Control－MV組，LPS－MV 組的肺組織TJ 的ZO－1，Occludin 及Claudin－5 的表達均降低（P＜0.05，n ＝4，圖4）。

3 討 論

炎性細胞在急性肺損傷的發(fā)展過程中占據(jù)重要地位，而肺泡巨噬細胞是肺部對抗刺激的第一道防線，也是肺組織中占主導地位的免疫細胞［7］。 肺損傷發(fā)生后，肺部細胞均可分泌胞外囊泡，例如肺泡巨噬細胞、肺上皮細胞、肺血管內皮細胞及中性粒細胞等［8］，研究發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中存在大量上述細胞分泌的胞外囊泡［5］，但不同時期胞外囊泡的主要來源有所不同。 在感染所致急性肺損傷早期，肺泡巨噬細胞激活，分泌大量MVs，其作為生物介質載體，在肺部細胞間起著傳遞作用。

圖4 巨噬細胞來源的MVs 對緊密連接相關蛋白表達的影響

小鼠原代肺泡巨噬細胞難以大量獲取，本項研究采用大量培養(yǎng)MHS 以獲取足量MVs。 本項研究發(fā)現(xiàn)MHS 培養(yǎng)過程中可產生大量的MVs，LPS 刺激肺泡巨噬細胞后產生的MVs 可導致正常小鼠發(fā)生肺損傷。 MVs 根據(jù)巨噬細胞的不同活性在胞內主動包裹較多生物活性物質，并將其攜帶進入其它細胞或組織。 研究表明巨噬細胞來源的MVs 早期攜帶較多 腫瘤 壞死 因子 蛋白 及microRNA 等［6，9－10］。MVs 可被鄰近的肺上皮細胞及肺血管內皮細胞等吸收，通過攜帶的活性介質影響其它細胞活性。 So?ni 等［6］發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞來源的MVs 可增加小鼠肺上皮細胞的細胞間黏附分子－1 及角化細胞來源細胞因子的表達，影響上皮細胞活性。 而Zhang等［10］通過對炎性肺泡巨噬細胞來源的MVs 中mi?coRNA 的探究發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞來源的miR－223／142 可抑制肺部炎性小體活性。 表明炎性肺泡巨噬細胞來源的胞外囊泡包裹的生物活性物質既包括損傷性因子，也存在保護性物質。 此外，巨噬細胞來源的胞外囊泡在各類疾病，如心肌損傷、腎損傷、關節(jié)炎等均扮演著重要角色［6，9，11］。 新近研究亦考慮將肺泡巨噬細胞來源的MVs 作為肺損傷的標志物［10］，因其作為細胞特異性載體，可促進蛋白及miRNAs 的傳遞，為肺損傷的標志物探究提供可能性。 此外，新近研究也發(fā)現(xiàn)干細胞來源的胞外囊泡對肺損傷存在治療作用［12］。

緊密TJ 由Occludin、Claudins－5 及ZO－1 等組成，其在肺泡內皮屏障間起著重要作用［13］。 肺泡上皮細胞或內皮細胞Occludin、ZO－1 等蛋白表達的減少通常導致肺血管通透性增加，導致肺損傷或水腫。本項研究中發(fā)現(xiàn)LPS 刺激后的巨噬細胞來源的MVs 減少了肺組織Occludin，Claudin－5 及ZO－1 的蛋白表達，但對照組MVs 未對TJ 蛋白的表達造成影響，這可能是炎性巨噬細胞來源的MVs 引發(fā)肺損傷的原因之一。 據(jù)報道肺組織的TJ 的表達受到炎癥反應的影響［14］。 巨噬細胞來源的MVs 可攜帶炎性因子進入肺上皮細胞、血管內皮細胞及細胞間隙［15］，可能以此途徑降低TJ 的表達。

綜上所述，炎性巨噬細胞可產生大量MVs，影響肺部TJ 的表達，并可對肺組織造成損傷。 MVs 作為細胞間的溝通橋梁，其在肺損傷中的作用機制并未完全明確，仍待更深入地機制探討。