黃顯曄，謝宇庭，張鵬宇

（1. 黑龍江省大慶市杜爾伯特縣畜牧技術(shù)服務(wù)中心，黑龍江 大慶 163000；2. 黑龍江省齊齊哈爾市畜牧總站，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

益生菌是調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡的重要微生物，近年來成為研究的熱點(diǎn)，多項(xiàng)研究表明益生菌具有維持腸道菌群平衡、抑制致病菌繁殖、提高機(jī)體免疫力，降低腹瀉率及促進(jìn)飼料消化吸收等功能。2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第194 號(hào)公告，鼓勵(lì)企業(yè)和研發(fā)機(jī)構(gòu)加快開發(fā)生物飼料、酶制劑、益生菌、植物提取物等抗生素替代產(chǎn)品，促進(jìn)畜牧業(yè)抗生素減量替代，確保畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全，其中益生菌在畜牧獸醫(yī)行業(yè)中具有巨大的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)用糞腸球菌由仔豬直腸分離得到，經(jīng)過相關(guān)鑒定及試驗(yàn)已確定其為益生菌，通過本次體外耐受性試驗(yàn)，驗(yàn)證其是否耐酸、耐膽鹽及耐高溫，為進(jìn)一步研制微生態(tài)制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 糞腸球菌(Enterococcus faecium)DM-F16 由大慶市某豬場(chǎng)仔豬直腸內(nèi)容物分離獲得。

1.2 試劑及設(shè)備 LB 固體培養(yǎng)基、LB 肉湯培養(yǎng)基（山東拓普生物工程有限公司）、豬膽鹽（索萊寶科技有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、立式小容量恒溫培養(yǎng)搖床（上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）。

1.3 菌液制備 用無菌接種環(huán)挑取少量試驗(yàn)菌株于LB 平板培養(yǎng)基上，劃線，37℃溫箱培養(yǎng)24h，挑取單一菌落，接種到LB 肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后平板計(jì)數(shù)，取用菌液濃度為1.2×108cfu.mL-1。

1.4 糞腸球菌體外存活率計(jì)算 參考文獻(xiàn)方法[7]以下列公式進(jìn)行計(jì)算糞腸球菌體外存活率。

1.5 菌株耐酸性試驗(yàn) 用濃鹽酸調(diào)節(jié)已配制好的LB 肉湯培養(yǎng)基，pH 值分別為2.0、3.0、7.0。

按2%的量接種菌液，37℃，180r.min-1搖床內(nèi)培養(yǎng)，分別于1h、2h 和3h 取樣100μL 進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并計(jì)算糞腸球菌體外存活率。

1.6 耐膽鹽試驗(yàn) 菌種分別接種于含豬膽鹽為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%LB 肉湯培養(yǎng)基中，接菌量為體積的2%，然后置于180r.min-1搖 床 內(nèi)37℃培 養(yǎng)，于1h、2h、4h 和8h 取 樣100μL，平板計(jì)數(shù)及計(jì)算糞腸球菌體外存活率。

1.7 高溫耐受試驗(yàn) 取試驗(yàn)菌液分別置于試管中，在37℃、50℃、60℃、80℃下水浴，分別于培養(yǎng)的第3min、10min、15min、30min 取樣100μL，平板計(jì)數(shù)及計(jì)算糞腸球菌體外存活率。

2 結(jié) 果

2.1 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

糞腸球菌DM-F16 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，在pH是2.0 培養(yǎng)基中，隨著時(shí)間的延長糞腸球菌的存活率明顯下降，當(dāng)培養(yǎng)3h 后菌濃度下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，存活率僅有2%左右，在pH 值為3.0 和7.0 的濃度下存活率隨著時(shí)間的延長逐漸增大，可推斷出該菌株對(duì)pH 為3.0 以上的酸度環(huán)境生長適應(yīng)良好。

表1 糞腸球菌DM-F16 對(duì)不同pH 的體外存活率（%）

表2 糞腸球菌DM-F16 對(duì)不同濃度膽鹽的體外存活率（%）

2.2 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

糞腸球菌DM-F16 的耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示，膽鹽濃度在0.1%～0.2%能很好的生長，在濃度0.3%時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，存活率有所下降，在培養(yǎng)8h 后存活率僅為75.65%，說明菌株對(duì)該濃度膽鹽有一定的耐受性，但在含0.5%膽鹽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h 后存活率下降了90%，說明菌株對(duì)高濃度膽鹽缺少耐受性。

表3 糞腸球菌DM-F16 對(duì)不同溫度的體外存活率（%）

2.3 高溫耐受試驗(yàn)結(jié)果

如表3 結(jié)果所示，菌株DM-F16 在不同溫度下培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)隨時(shí)間延長正常生長，在50℃存活率逐漸下降，培養(yǎng)30min 后取樣發(fā)現(xiàn)存活率為46.76%，60℃高溫下培養(yǎng)30min 存活率僅為21.09%，說明該菌株對(duì)高溫敏感。

3 討 論

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）屬于革蘭氏陽性菌，在人和動(dòng)物的腸道中廣泛存在，糞腸球菌具有很多毒力因子，可引起胃腸道、口腔及泌尿道等感染，另一方面該菌可產(chǎn)生細(xì)菌素等物質(zhì)抑制其他病原菌繁殖從而改善宿主腸道微環(huán)境，亦可抑制腸道中產(chǎn)尿素酶細(xì)菌和腐敗菌的繁殖降低內(nèi)毒素及血氨含量，有研究表明糞腸球菌具有較強(qiáng)上調(diào)腸上皮細(xì)胞SERTmRNA 和蛋白表達(dá)的作用能夠增加5-HT 的再攝取從而減弱胃腸道癥狀；因此篩選具有益生菌特性的糞腸球菌菌株并研制相關(guān)微生態(tài)制劑，其安全性、益生菌樣功能及菌株的體外耐受性是很重要的考察指標(biāo)；其中體外耐受性主要是模擬菌體通過動(dòng)物胃腸道，對(duì)胃腸道環(huán)境適應(yīng)性、制成微生態(tài)制劑過程及成品運(yùn)輸中對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力。

本試驗(yàn)菌株來源于仔豬，將主要研制成仔豬用微生態(tài)制劑，因此需要考慮仔豬腸道環(huán)境的特殊性，消化道是個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，尤其仔豬斷奶后一段時(shí)間內(nèi)消化道環(huán)境較育成豬的變化更多：胃內(nèi)的pH 值從斷奶前的pH4.0 左右到斷奶后升高至pH5.5 左右，然后開始下降，仔豬60 日齡后漸漸達(dá)到成豬的pH3.0 左右；而腸道內(nèi)的酸度逐漸降低達(dá)到中性偏堿性，其中起主要作用的是膽汁，濃度大約在0.03%～0.3%，試驗(yàn)?zāi)M腸道中膽汁濃度進(jìn)行菌株的耐膽鹽能力考查；在高溫試驗(yàn)中主要是針對(duì)制劑過程中加熱溫度的考察，是否能夠耐受一定的高溫，本試驗(yàn)菌株對(duì)高溫敏感，因此在研制微生態(tài)制劑過程中是重要的影響因素。

本試驗(yàn)所用菌株由仔豬直腸分離得到，已通過其培養(yǎng)特征、菌落及菌體形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16SrDNA 序列分析已確定為糞腸球菌，又經(jīng)過一系列安全試驗(yàn)及益生菌特性試驗(yàn)已確定其安全性及具有益生菌作用。經(jīng)過耐酸、耐膽鹽、耐高溫試驗(yàn)，結(jié)果表明分離的糞腸球菌具有較好的耐酸性及耐膽鹽能力，但對(duì)高溫敏感，試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研制益生菌制劑提供了可靠數(shù)據(jù)。