宿文杰，張玉堯，周 媛，宋柏林，趙大慶，張 鶴,3*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.寧江社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，吉林 松原 138000；3.長(zhǎng)春中醫(yī)院大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021）

哈蟆油（Ovicutus Rana）為蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙（Rana temporaria chensinensisDavid）雌蛙的輸卵管，為滋補(bǔ)藥材之首，具有補(bǔ)腎益精、健脾益胃、滋陰補(bǔ)腎、潤(rùn)肺生津等功效。林蛙的輸卵管[1]呈現(xiàn)乳白色或黃白色，有脂肪樣光澤，手摸滑潤(rùn)，質(zhì)硬易折斷；有特殊的油脂氣味和腥味，味微甘，嚼之有黏滑感；膨脹度＞55；其主要成分為蛋白質(zhì)，含量約占50%以上[2]。偽品牛蛙的輸卵管為不規(guī)則彎曲，管徑不均一，不透明的暗黃色，無(wú)光澤手摸無(wú)滑膩感，質(zhì)地較硬、脆。牛蛙油溫水浸泡膨脹度＜30，粗蛋白含量為39.96%～47.50%[3]。在目前研究中，偽品牛蛙的輸卵管從性狀、顯微、薄層色譜等方面與哈蟆油均可辨別區(qū)分。目前研究哈蟆油中特異性的成分除1-甲基海因外[4]，鮮有特異性成分發(fā)現(xiàn)。本文采用iTRAQ 技術(shù)比較哈蟆油和牛蛙油的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行功能分析和代謝通路分析，篩選兩個(gè)種屬蛙在冬眠前輸卵管蛋白組成的差異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與生長(zhǎng)環(huán)境、發(fā)育的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 林蛙采于蛟河市前進(jìn)鄉(xiāng)、永吉縣北大湖鎮(zhèn)、舒蘭市上營(yíng)鎮(zhèn)、樺甸市紅石砬子鎮(zhèn)、集安市清河村、安圖縣三道灣鎮(zhèn)，牛蛙采自于福建省漳州市。

1.2 主要儀器和試劑 Q-Exactive 質(zhì)譜儀，Thermo Finnigan 公司；AKTA Purifier 100 純化儀，600Ⅴ電泳儀，GE Healthcare 公司；5430R 型低溫高速離心機(jī)，真空離心濃縮儀，Eppendorf公司；胰蛋白酶，promega公司；iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit，AB SCIEX 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛙油提取 取活蛙腹部解刨，取兩側(cè)輸卵管，去掉筋膜、卵等雜質(zhì)，用蒸餾水清洗干凈后低溫冷凍干燥，研磨成粉末待用。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取 每組樣品稱取10 mg，加入1 mL SDT 裂解液，充分勻漿后沸水浴5 min，超聲破碎，14 000 g 離心45 min，取上清-80℃保存。SDS-PAGE法測(cè)定樣品中蛋白含量。

1.3.3 iTRAQ 定量 每份樣品各取250 μg，胰蛋白酶消化，酶解后的肽段用8 標(biāo)iTRAQ 試劑標(biāo)記113（哈蟆油），114（哈蟆油）和117（牛蛙油）。采用第一維強(qiáng)陽(yáng)離子交換液相色譜分級(jí)，第二維采用納升流速HPLC 液相系統(tǒng)進(jìn)行分離，每份樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.4 差異蛋白篩選 對(duì)樣本哈蟆油113（A）和114（B）與牛蛙油117（E）中1 220 個(gè)蛋白質(zhì)定量信息進(jìn)行顯著性分析，其中篩選條件標(biāo)準(zhǔn)為比值＞1.5（或比值＜0.67），且P值＜0.05。

1.3.5 生物信息學(xué)分析

1.3.5.1 GO 功能注釋分析 利用WEGO 軟件對(duì)鑒定到的差異蛋白進(jìn)行細(xì)胞組分、生物學(xué)途徑和分子功能分析，計(jì)算中GO 選擇Level2 進(jìn)行匯總。

1.3.5.2 KEGG 通路注釋 利用KAAS 將目標(biāo)蛋白序列與KEGG GENES數(shù)據(jù)庫(kù)中的兩棲綱蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)同源/相似蛋白的KO號(hào)注釋到相關(guān)KEGG通路上。

2 結(jié)果

2.1 牛蛙油與哈蟆油差異蛋白篩選的結(jié)果 見(jiàn)表1，見(jiàn)表2。

表1 牛蛙油與哈蟆油相比上調(diào)的蛋白質(zhì)

表1 （續(xù)）

表2 牛蛙油與哈蟆油相比下調(diào)的蛋白質(zhì)

2.1.1 牛蛙油含量較高的特異性蛋白 從表1 可以看出，牛蛙油與哈蟆油蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析中上調(diào)的蛋白質(zhì)共計(jì)69 個(gè)。其中參與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的Ada2、Fam3c、Ovch2、Ahnak、Cp、Nup93、Calm2、Capns2、H2az2、H3.2、TGas113e22.1、H2A-IX、Eef1A、Arl1、Iebf2 等；參與能量代謝的蛋白包括Hadhb、Atp5g1、Aldoc 等；參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白包括Ldha、Hyou1、Cp、Hpx、Hsp90b1、HSP90B1 等；參與骨架形成的蛋白包括Keratin、Actin、Cfl1、Tubulin等；參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白包括Psme1、Psma7-b、TM9SF1、Sort1 等；參與免疫調(diào)節(jié)的蛋白包括Mug2、ColIA1、ColIA2、ColⅤA1 等；參與氧化還原的蛋白包括Prx、Sqor 等。

2.1.2 哈蟆油含量較高的特異性蛋白 從表2 可以看出，牛蛙油與哈蟆油相比下調(diào)的蛋白質(zhì)有8 個(gè)，其中參與免疫調(diào)節(jié)的蛋白包括Akap13、Fcgbp、Muc5AC、Muc2、Muc5B 和tPCase 等。

2.2 GO 注釋分析結(jié)果 利用WEGO 軟件對(duì)鑒定到的差異蛋白功能類別進(jìn)行GO 功能富集計(jì)算。在Level 2水平上對(duì)差異蛋白在細(xì)胞組分、生物學(xué)途徑和分子功能中分布情況進(jìn)行分析。見(jiàn)圖1。

從圖1 細(xì)胞組分中可以看出差異蛋白主要集中在細(xì)胞、細(xì)胞器、大分子復(fù)合體和胞外區(qū)等9 個(gè)蛋白類，其中細(xì)胞、細(xì)胞器類和大分子復(fù)合體蛋白質(zhì)的數(shù)量最多，分別占所有差異蛋白質(zhì)的27.92%、22.08%和16.88%。

從圖1 生物學(xué)途徑中看出，細(xì)胞過(guò)程、代謝途徑、單一生物過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、定位途徑、繁殖途徑、生長(zhǎng)過(guò)程和運(yùn)動(dòng)過(guò)程等是差異蛋白質(zhì)比較集中的17 個(gè)生物學(xué)途徑。其中細(xì)胞過(guò)程、代謝途徑、單一生物過(guò)程和生物調(diào)節(jié)類蛋白質(zhì)數(shù)量較多，分別占所有差異蛋白的17.98%、16.10%、14.61%和10.86%。

圖1 牛蛙油與哈蟆油差異蛋白GO 分析

從圖1分子功能中可以看出結(jié)合功能、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、受體活性、抗氧化活性、酶調(diào)節(jié)活性等是差異蛋白質(zhì)比較集中的11 個(gè)分子功能。其中結(jié)合功能與催化活性類蛋白質(zhì)數(shù)量最多，占所有差異蛋白質(zhì)的51.04%和29.17%。

2.3 KEGG 代謝通路分析 牛蛙油與哈蟆油的差異蛋白總數(shù)為77 個(gè)，共提取到41 個(gè)差異蛋白map 到100條KEGG 信號(hào)通路。41 個(gè)差異蛋白中包括40 個(gè)上調(diào)蛋白map 到99 個(gè)KEGG 代謝通路和1 個(gè)下調(diào)蛋白map 到1 個(gè)KEGG 代謝通路。

與哈蟆油蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)比，牛蛙油中含量較高的Calm2 參與Rap1 信號(hào)通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等30 個(gè)代謝通路；Aldoc 參與糖酵解、糖異生、果糖和甘露糖等7 個(gè)代謝通路；Hadhb參與脂肪酸延長(zhǎng)、脂肪酸降解、脂肪酸代謝等5 個(gè)代謝通路；Ldha 參與糖酵解、糖異生、丙酮酸代謝、丙酸鹽代謝4 個(gè)代謝通路。

哈蟆油中含量較高的1 個(gè)差異蛋白tPCase 參與氨基糖和核苷酸糖代謝過(guò)程。

3 討論

3.1 生活習(xí)性差異 中國(guó)林蛙是典型的水陸兩棲性生物，它的年生活周期可分為水生生活期和陸生生活期[5]。中國(guó)林蛙冬眠分為3 個(gè)階段：入蟄期、散居冬眠期、冬眠活動(dòng)階段[6]。冬眠前機(jī)體營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備充足，為長(zhǎng)期休眠和翌年的排卵提供良好的營(yíng)養(yǎng)條件。冬眠期蛙類機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)水平、代謝水平、內(nèi)分泌水平等都處于最低水平，減少能量的消耗[7]。

牛蛙的適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由卵孵化成蝌蚪，由蝌蚪變化到成體，共需4～5 年；氣溫降至10 ℃以下，牛蛙開(kāi)始藏匿于洞穴或淤泥中，停止活動(dòng)與攝食，進(jìn)入冬眠期。多數(shù)牛蛙均為南方養(yǎng)殖，因此冬眠期較短[8]。冬眠前機(jī)體的能量富集以維持蛙冬眠的整個(gè)階段和冬眠后的繁殖。由于中國(guó)林蛙與牛蛙的生活習(xí)性的不同，通過(guò)比較牛蛙油和哈蟆油蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選兩個(gè)種屬蛙在冬眠前輸卵管蛋白組成的差異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與生長(zhǎng)環(huán)境、發(fā)育的關(guān)系。在牛蛙油中高表達(dá)的69 個(gè)蛋白質(zhì)主要參與生長(zhǎng)發(fā)育、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞骨架形成、生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)和氧化還原等過(guò)程。而在哈蟆油中高表達(dá)的蛋白質(zhì)有8 個(gè)，主要參與免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。

3.2 哈蟆油特異性膨脹度 哈蟆油具有較高的膨脹度是哈蟆油區(qū)別于其他偽品蛙油的重要的鑒別方法。本文通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)黏蛋白類成分Muc2、Muc5AC、Muc5B 和類似黏蛋白Fcgbp 在哈蟆油中含量較高，這三種類型的黏蛋白屬于凝膠形成型的黏蛋白，高度糖基化的黏蛋白具有相當(dāng)?shù)谋Ｋ芰?，并通過(guò)吸收大量水分形成凝膠[9]；黏蛋白結(jié)構(gòu)中包含半胱氨酸富含區(qū)域中，C 端D 結(jié)構(gòu)域形成二硫鍵連接形成二聚體，N端的D 結(jié)構(gòu)域形成二硫鍵參與的三聚體，進(jìn)而形成黏蛋白的分子量較高不溶于水的特點(diǎn)[10]。因此哈蟆油具有較高的膨脹度與哈蟆油中含量較高的黏蛋白類成分密切相關(guān)。

3.3 結(jié)論 由于中國(guó)林蛙與牛蛙的生活習(xí)性的不同導(dǎo)致哈蟆油與牛蛙中蛋白質(zhì)含量的差異，本研究通過(guò)比較牛蛙油與哈蟆油蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的差異，篩選哈蟆油中含量較高的8 個(gè)差異蛋白主要參與免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程；牛蛙油中含量較高的69 個(gè)差異蛋白主要參與生長(zhǎng)發(fā)育、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞骨架形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)和氧化還原等過(guò)程；其中Akap13、Fcgbp、Muc5AC、Muc2、Muc5B 等8 個(gè)高表達(dá)的蛋白可作為哈蟆油區(qū)別于牛蛙油的重要蛋白質(zhì)，同時(shí)哈蟆油的特異性膨脹度可能與含量較高的黏蛋白類密切相關(guān)，本文的研究結(jié)果為進(jìn)一步研究哈蟆油的功效成分奠定基礎(chǔ)。