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        孔雀石綠膠體金檢測(cè)樣品前處理工藝的優(yōu)化

        2021-05-22 03:42:20高海崗劉秀梵王曉泉蔣春茂鄭硯超
        中國飼料 2021年9期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

        高海崗, 劉秀梵*, 王曉泉, 蔣春茂, 鄭硯超

        (1.揚(yáng)州大學(xué),江蘇揚(yáng)州225009;2.江蘇農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇泰州225300;3.無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司,江蘇無錫214174)

        孔雀石綠又叫孔雀綠、堿性綠,是一種人工合成的三苯甲烷類燃料(陳義元,2018),因其在細(xì)菌合成過程中能阻止蛋白肽的形成而具有殺菌效果,被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和運(yùn)輸領(lǐng)域。但孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠(LMG)具有致癌、致畸和致突變毒性, 已被多國禁用,2002 年農(nóng)業(yè)部頒布的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中明確禁止使用孔雀石綠等多種違禁藥物。 但多年來的檢測(cè)結(jié)果顯示, 我國部分省市在養(yǎng)殖領(lǐng)域和流通領(lǐng)域還在長期使用(師真等,2020;林锏銳等,2019;范芳芳等,2019),嚴(yán)重危害農(nóng)產(chǎn)品食用安全。

        根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示,國內(nèi)市面上出售的水產(chǎn)品中孔雀石綠、 硝基呋喃類藥物、 氯霉素的檢出率為6.5% ~ 23.2%(李菊等,2020)。 為快速監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖領(lǐng)域和流通領(lǐng)域違法使用獸藥,我國出現(xiàn)了大量的快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)試紙條。 目前前處理方法一般為使用乙腈、二氯甲烷提取,硼氫化鉀等進(jìn)行還原,使孔雀石綠還原成隱性孔雀石綠檢測(cè)(劉柳等,2020;王雪峰等,2018);或者直接用乙腈提取,中性氧化鋁凈化,直接上機(jī)檢測(cè)(朱飛如和馮俊富,2018)。但由于前處理方法過于復(fù)雜,仍然不能保證在有限的時(shí)間內(nèi),快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)違禁藥物。本實(shí)驗(yàn)采用提取、氧化、濃縮和復(fù)溶四個(gè)步驟,對(duì)氮吹、SPE柱、 反萃取三種不同提取方式進(jìn)行前處理比較,通過膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè),旨在對(duì)建立基層快速檢測(cè)方法提供指導(dǎo)性建議。

        1 材料與方法

        1.1 試劑 孔雀石綠快速檢測(cè)試紙條、SPE-HLB柱,由無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司提供;氯化鈉、鹽酸羥胺、乙酸鈉、甲醇、無水硫酸鈉、中性氧化鋁、乙酸乙酯、四氯苯醌、乙腈、吐溫-20 均為分析純,購自國藥集團(tuán);隱性孔雀石綠、孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品,購自德國DR.E。

        1.2 儀器 振蕩器,購自其林貝爾儀器制造有限公司;離心機(jī),購自萬合儀器制造有限公司;氮吹儀,購自無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司;固相萃取裝置,購自冠森生物科技(上海)有限公司。

        1.3 前處理實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) (kj201701) 樣本的提取:準(zhǔn)確稱取試樣2 g(精確至0.01 g)置于15 mL 具塞離心管中,用紅色油性筆標(biāo)記,依次加入1 mL飽和氯化鈉溶液,0.2 mL 鹽酸羥胺溶液,2 mL 乙酸鹽緩沖液及6 mL 乙腈,渦旋提取2 min(食品快速檢測(cè)方法數(shù)據(jù)庫,2021)。 氧化和濃縮: 加入1 g 無水硫酸鈉,1 g 中性氧化鋁, 渦旋混合1 min,以4600 r/min 離心5 min。 準(zhǔn)確移取5 mL 上清液于15 mL 離心管中, 加入1 mL 正已烷, 充分混勻,以4600 r/min 離心1 min。 準(zhǔn)確移取4 mL 下層液于15 mL 離心管中, 加入100 μL 二氯二氰基苯醌溶液,渦旋混勻,反應(yīng)1 min,于55 ℃水浴中氮?dú)獯蹈伞?復(fù)溶:精密加入200 μL 復(fù)溶液,渦旋混合1 min,作為待測(cè)液,立即測(cè)定。

        1.3.2 氮吹改良方法 樣本的提取:稱取去皮、去脂肪并均質(zhì)的樣本5 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管,加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品,依次加入3 mL 飽和氯化鈉溶液, 7 mL 乙酸乙酯,于振蕩器上劇烈振蕩3 min,4000 r/min 離心5 min; 氧化和濃縮:取上清4 mL 于7 mL 離心管中, 加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液, 振蕩混勻后, 置于氮吹儀中,65 ℃加熱吹干;復(fù)溶和凈化:取出上述7 mL離心管, 加入2 mL 正己烷, 輕輕振蕩至溶解殘?jiān)?,再加?.8 mL 0.5%吐溫-20 水溶液,于振蕩器上劇烈振蕩1 min,4000 r/min 離心1 min。取出離心管后,去除上層正己烷,下層溶液即為待測(cè)液。

        1.3.3 反萃取方法 樣本的提取方法同1.3.2;氧化和調(diào)整極性:取上清4 mL 于15 mL 離心管中,加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液,振蕩混勻后,加入10 mL 正己烷,于振蕩器上劇烈振蕩3 min;反萃?。喝〕錾鲜?5 mL 離心管,加入500 μL 0.2 mol/L 硼酸溶液, 于振蕩器上劇烈振蕩1 min,4000 r/min 離心1 min, 去除上層有機(jī)相,取下層溶液400 μL 于2 mL 離心管中,再加入400 μL 0.05 mol/L 四硼酸鈉溶液, 混勻后即為待測(cè)液。

        1.3.4 SPE 柱法 樣本的提取方法同1.3.2;氧化和調(diào)整極性:取上清4 mL 于15 mL 離心管中,加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液, 振蕩混勻后, 加入10 mL 正己烷, 于振蕩器上劇烈振蕩3 min;SPE 吸附:將上述液體按0.6 mL/min 的速度,勻速過HLB 小柱;SPE 洗脫: 加入1 mL 10%甲醇-水溶液于上述SPE 柱中, 按每秒一滴的速度勻速洗脫,洗脫液即為待測(cè)液。

        1.4 質(zhì)控實(shí)驗(yàn) 每種樣品同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控實(shí)驗(yàn)。

        1.4.1 空白實(shí)驗(yàn) 稱取魚肉樣本, 按照1.3 中不同方法進(jìn)行樣本制備。

        1.4.2 加標(biāo)質(zhì)控實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取空白樣本適量,按照梯度加入一定量的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液, 使孔雀石綠濃度為0.25、0.5、1、2、4 ng/mL;準(zhǔn)確稱取空白樣本適量, 按照梯度加入一定量的隱性孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液,使孔雀石綠濃度為0.25、0.5、1、2、4 ng/mL。

        1.5 膠體金免疫層析試紙條使用方法及判讀示意圖

        1.5.1 使用方法 (1)從原包裝鋁箔袋中取出檢測(cè)卡和酶標(biāo)孔,恢復(fù)至室溫;(2)用移液器吸取待檢樣品溶液100 μL 于酶標(biāo)孔中, 反復(fù)吹打至孔內(nèi)紅色物質(zhì)完全溶解,等待反應(yīng)2 min;(3)將檢測(cè)卡平放,吸取孔內(nèi)所有溶液滴加到加樣孔中,加樣后開始計(jì)時(shí);(4)反應(yīng)5 min 根據(jù)示意圖判斷結(jié)果,其他時(shí)間判讀無效。

        1.5.2 結(jié)果判讀 膠體金免疫層析試紙條判讀示意圖如圖1 所示。 陰性結(jié)果:T 線比C 線深,或一樣深,表示樣本中孔雀石綠濃度低于其檢測(cè)限;陽性結(jié)果:T 線比C 線淺,或T 線顯綠色,表示樣本中孔雀石綠濃度高于其檢測(cè)限;無效反應(yīng):如果測(cè)試結(jié)果C 線未出現(xiàn),表示此試劑已失效。

        圖1 膠體金免疫層析試紙條判讀示意圖

        2 結(jié)果與分析

        2.1 靈敏度比對(duì) 分別用行標(biāo)法以及本實(shí)驗(yàn)中的三種前處理方法進(jìn)行最低檢測(cè)限,其中氮吹的最低檢測(cè)限最低,為隱性孔雀石綠0.5 ng/mL。 SPE 方法的最低檢測(cè)限為隱性孔雀石綠1 ng/mL。 反萃取方法和行標(biāo)法的最低檢測(cè)限最高,為隱性孔雀石綠2 ng/mL(圖2)。

        圖2 不同濃度的LMG 檢測(cè)結(jié)果

        2.2 四種方法準(zhǔn)確性比對(duì) 分別測(cè)試了行標(biāo)法以及本實(shí)驗(yàn)中三種前處理方法的準(zhǔn)確性, 在0、0.25、0.5、1、2、4 ng/mL 六種加標(biāo)濃度下, 每種方法每個(gè)濃度分別測(cè)試20 份樣本,每種濃度下顯示的陰陽性數(shù)量如表1。 在陰性、檢出限及2 倍檢出限這三個(gè)濃度點(diǎn)上, 四種方法的準(zhǔn)確性均為100%;特別考察了半數(shù)檢出限的準(zhǔn)確性,其中改良氮吹法準(zhǔn)確性最高,假陽性率為10%,行標(biāo)法假陽性率為15%,反萃取法假陽性率為25%,SPE方法假陽性率最高,為40%。

        表1 四種方法不同濃度下的陰陽性數(shù)量

        2.3 行標(biāo)法及改良的三種方法前處理用時(shí)比對(duì)分別對(duì)比了行標(biāo)法以及本實(shí)驗(yàn)中三種前處理方法的用時(shí),結(jié)果見表2。 其中,反萃取法由于省略了氮吹、過柱等步驟,用時(shí)最短,只需要23 min;SPE 法過柱洗脫時(shí)間明顯短于氮吹濃縮的時(shí)間, 用時(shí)32 min; 改良氮吹法相對(duì)于行標(biāo)法減少了試劑加入量,且乙酸乙酯揮發(fā)更快,用時(shí)41 min;行標(biāo)法用時(shí)最長,需要48 min。

        表2 四種方法前處理用時(shí) min

        3 討論

        試劑盒是否能用于臨床檢驗(yàn), 一般通過準(zhǔn)確率、假陽性率、假陰性率、變異系數(shù)、提取率、特異性、操作步驟和檢測(cè)時(shí)間來判斷(李菊等,2020)。在膠體金檢測(cè)卡的開發(fā)中, 主要考量的是準(zhǔn)確性和靈敏度,而對(duì)于膠體金的廣泛使用,前處理的工藝顯得尤為重要,在操作步驟、提取率和提取時(shí)間上的優(yōu)化,能夠使檢測(cè)變得更快捷,更易于基層推廣使用。

        根據(jù)GB31650-2019,孔雀石綠為0.5 ng/mL,行業(yè)快檢要求檢測(cè)限孔雀石綠為2 ng/mL。 本文對(duì)三種同時(shí)檢測(cè)隱性孔雀石綠前處理方法進(jìn)行研究和比較, 該三種方法都能達(dá)到同時(shí)檢測(cè)隱性孔雀石綠效果。 其中改良氮吹法的最低檢測(cè)限能達(dá)到國標(biāo)方法的最低檢測(cè)限,反萃取方法和SPE 方法的最低檢測(cè)限也都符合國家快檢方法的最低檢測(cè)限要求。相比于國標(biāo)方法,該三種方法無論從時(shí)間、成本、操作難度等方面,都具有很大優(yōu)勢(shì),對(duì)我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的監(jiān)管具有積極意義。

        反向萃取法用時(shí)最短, 提取率較其他兩種方法偏低。SPE 方法油脂等雜質(zhì)去除的最干凈,但成本高,操作要求嚴(yán)格。 改良氮吹方法提取率最高,但用時(shí)較長。

        本實(shí)驗(yàn)對(duì)三種前處理方法與行標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比,在陰性、 檢出限及2 倍檢出限這三個(gè)濃度點(diǎn)上,四種方法的準(zhǔn)確性均為100%; 半數(shù)檢出限的準(zhǔn)確性存在較大差異, 其中改良氮吹法準(zhǔn)確性最高,假陽性率為10%,行標(biāo)法假陽性率為15%,反萃取法假陽性率為25%,SPE 方法假陽性率最高,為40%。 出現(xiàn)半數(shù)檢出限假陽性的原因可能是氮吹后油脂殘留過多,SPE 過柱時(shí)流速不穩(wěn)定等原因造成的。 但具體的影響因素和影響機(jī)理,如何減弱或盡量避免這些影響因素, 都有待進(jìn)一步研究。

        反向萃取法從樣品提取到檢測(cè),用時(shí)最短,總時(shí)間不超過45 min,在限值范圍內(nèi),準(zhǔn)確率最高,能夠避免使用其他大型儀器, 方便基層的快速使用,使建立第三方快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室成為可能。

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