周江煜，侯小濤，3，韋宏官，戴航

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530200；2.廣西萬壽堂藥業(yè)有限公司，廣西南寧530219；3.廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530200）

滇桂艾納香為菊科植物假東風(fēng)草Blumea riparia（Bl.）DC.的干燥全草，主要產(chǎn)于廣西西南部和云南東南部［1］，為廣西壯瑤族民間草藥。其味淡，性平，具有活血化瘀、止血調(diào)經(jīng)的功效［2-4］，在廣西尤其是百色地區(qū)有較長的使用歷史，有較好的開發(fā)利用前景。滇桂艾納香的主要化學(xué)成分有黃酮類、原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸等［5-8］。本研究分別采用紫外分光光度法和高效液相色譜法對不同產(chǎn)地不同收集期滇桂艾納香的總黃酮及原兒茶酸含量進(jìn)行分析，為滇桂艾納香的采收和進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材滇桂艾納香藥材采自廣西百色和河池，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)郭敏副教授鑒定為菊科植物滇桂艾納香Blumea riparia（Bl.）DC.的干燥全草。

1.2 儀器島津UV-2550紫外分光光度計(jì)；Agilent 1100高效液相色譜儀，包括G1311A系列四元梯度泵，Agilent VWD檢測器，手動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，Agilent 1100色譜工作站；SB 2200型超聲波清洗儀（上海）；賽多利斯BP211D電子天平（德國）。

1.3 試劑蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200306，供含量測定用）；原兒茶酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110809-200503，供含量測定用）。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品23.16 mg，加60%乙醇配制為100 ml溶液，置水浴中微熱使溶解，放冷，制得濃度為0.115 8 mg/ml的蘆丁對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備將滇桂艾納香藥材干燥、粉粹，過3號(hào)篩，準(zhǔn)確稱取粉末各約0.5 g至錐形瓶中，加50%乙醇50 ml，稱定重量。超聲提取45 min，冷卻，補(bǔ)重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 測定波長的選擇取蘆丁對照品溶液0.5 ml，置于10 ml容量瓶中，用30%乙醇補(bǔ)充至5 ml，加入0.3 ml的5%NaNO2溶 液，放 置5 min；加 入0.3 ml的10%Al（NO3）3溶液，放置6 min；加入2.0 ml的4%NaOH溶液，混勻后用30%乙醇稀釋至刻度，靜置10 min。在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行全波長掃描，在510 nm處有最大吸收值，因此確定總黃酮的測定波長為510 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取蘆丁對照品溶液0.0 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，各加30%乙醇使成5.0 ml，精密加入0.3 ml亞硝酸鈉溶液（1→20），搖勻，放置6 min；再加入0.3 ml硝酸鋁溶液（1→10），搖勻，放置6 min；加入氫氧化鈉溶液4.0 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。在510 nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.012 3X-0.001 2（r=0.999 9），表明線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)取10月份那坡縣采收的滇桂艾納香藥材，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，于510 nm處連續(xù)5次測定吸光度，代入公式計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果RSD為1.8%（n=5），表明該法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批藥材6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別測定吸光度，代入公式計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果RSD=1.9%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批藥材，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法，在3 h內(nèi)每隔30 min測定吸光度，代入公式計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果RSD=1.2%（n=6），表明樣品在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的滇桂艾納香藥材，加入一定量對照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理后測定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果總黃酮的平均回收率為101.8%，RSD=1.4%（n=6），表明加樣回收良好，結(jié)果見表1。

表1 總黃酮加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.1.9 總黃酮含量測定取不同產(chǎn)地不同采集期的滇桂艾納香藥材，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液。精確吸取0.5 ml樣品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法依次進(jìn)行測定。將測得的吸光度代入回歸方程計(jì)算出總黃酮含量，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地不同采集期滇桂艾納香藥材總黃酮的含量測定結(jié)果 （mg/g）

2.2原兒茶酸的含量測定參考文獻(xiàn)［9-11］的方法進(jìn)行測定。

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取原兒茶酸對照品12.51 mg，加甲醇配制成50 ml原兒茶酸對照品溶液，濃度為0.250 2 mg/ml。

2.2.2 供試品溶液的制備將滇桂艾納香藥材干燥、粉粹，過3號(hào)篩，取粉末各約0.5 g至錐形瓶中，加50%的乙醇50 ml，稱定重量。超聲提取45 min，冷卻，補(bǔ)足重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件色譜柱：Agilent Hypersil ODS Cl8柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（10∶89∶1）；檢測波長：256 nm；柱溫：室溫；經(jīng)測試，樣品峰分離度＞1.5，原兒茶酸理論塔板數(shù)＞3 000。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取12.51 mg原兒茶酸對照品，加甲醇配制成50 ml的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液1.0 ml，3.0 ml，5.0 ml，10 ml，25 ml，加甲醇分別配制成25 ml對照品溶液（濃度分別為10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml），在“2.2.3”項(xiàng)下的色譜條件下，分別進(jìn)樣5μl進(jìn)行測定。以原兒茶酸對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=5.849 9×103X+48.393 0（r=0.999 4）。結(jié)果表明：進(jìn)樣量在0.05～1.30μg范圍內(nèi)，原兒茶酸進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)取10月份那坡縣采收的滇桂艾納香藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液后進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄原兒茶酸峰面積比值，結(jié)果原兒茶酸的RSD值為1.8%（n=5），表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批滇桂艾納香藥材5份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液后進(jìn)樣分析，結(jié)果原兒茶酸RSD=1.8%（n=5）；表明方法的重復(fù)性較好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批滇桂艾納香藥材樣品溶液，在放置0 h，2 h，5 h，8 h，10 h，12 h后分別進(jìn)樣分析，結(jié)果原兒茶酸的RSD為1.9%（n=6），表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的滇桂艾納香藥材樣品，加入一定量對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液后進(jìn)樣分析，測得原兒茶酸的平均回收率為98.5%，RSD=2.1%（n=6），表明加樣回收良好，結(jié)果見表3。

表3 原兒茶酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.2.9 含量測定取不同產(chǎn)地不同采集期的滇桂艾納香，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液。分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各5μl，注入高效液相色譜儀，按“2.2.3”項(xiàng)下方法色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積代入回歸方程計(jì)算出原兒茶酸含量，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地不同采集期滇桂艾納香中原兒茶酸的含量測定結(jié)果 （μg/g）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對廣西8個(gè)不同產(chǎn)地不同采集期滇桂艾納香總黃酮、原兒茶酸進(jìn)行含量測定，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。對比表2、表4中的數(shù)據(jù)，滇桂艾納香不同產(chǎn)地總黃酮、原兒茶酸的含量在不同月份差異較大：10月份百色那坡縣采收的滇桂艾納香總黃酮的含量最高，11月百色田林縣采收的滇桂艾納香原兒茶酸含量最高。

綜合考慮藥材中總黃酮、原兒茶酸的含量，以那坡縣和田林縣10月、11月份滇桂艾納香中含量最高。其他生長月份雖然有某種有效成分含量較高，但其他有效成分含量卻偏低。因此，滇桂艾納香藥材的最佳產(chǎn)地為百色那坡縣和田林縣，最佳采收期為10月、11月。本文的研究可為進(jìn)一步開發(fā)利用滇桂艾納香提供依據(jù)。