張鈺明，譚佳威，洪婷婷，楊琳潔，劉蕾蕾，劉冬涵，杜守穎 ，白 潔，陸 洋

（北京中醫(yī)藥大學 中藥學院 , 北京 102488)

附子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，為有毒之品。生附子中的烏頭堿類是有效成分，同時也是毒性成分，需要經(jīng)過炮制后才能在臨床使用。在古籍中涉及到生附子的炮制方法有很多，演變至清代已有70 多種制法[1]。追溯到張仲景的《傷寒雜病論》：“皆破解，不咀，或炮或生，皆去黑皮，刀刲取里白者，故曰中白”，是關(guān)于附子炮制的最早記載。漢代首創(chuàng)火炮，炮熟性緩而補陽，且能減弱其毒性[2]。長期實踐驗證，炮附子毒性低、療效好、作用緩和，長于溫腎助陽、回陽救逆，為其它炮制品所不能替代[3]。

從古代文獻來看，“凡用附子、烏頭、天雄，皆熱灰微炮令坼，勿過焦[4]”。火炮法又分為古代干熱法、清炒法、烘烤法和砂燙法[5]。這四種制法均秉承了張仲景的學術(shù)思想，但從炮制后的效果和制備過程來看，古代的干熱法和清炒法炮制程度較難掌控，容易內(nèi)焦外生，質(zhì)量不均一，砂燙法與現(xiàn)代烘烤法可達到內(nèi)外皆黃和質(zhì)地酥脆的炮制要求；但考慮到現(xiàn)代烘烤法由于不同位置烘烤不均勻容易導致炮附子的差異較大，對控溫設(shè)備的要求較高，且飲片烘烤后質(zhì)地不如砂燙法酥脆，因此本實驗研究砂燙法對附子質(zhì)量的影響。

因附子的采收期是6 月下旬至8 月上旬，附子不易保存，鮮附子切片后更易干燥，以防發(fā)霉變質(zhì)；再加之砂燙附子無法觀察其炮制程度，操作不便，難度系數(shù)加大，因此最終采用經(jīng)產(chǎn)地加工（切片處理）的生附片進行砂燙。在臨床應用中附片多以湯劑形式入藥，故本實驗建立了附片水煎液的特征圖譜方法，并采用HPLC 來測定附片中生物堿的含量，從生物堿的含量、特征圖譜、出膏率三個方面分析炮制前后的附片的質(zhì)量屬性，為其后期的毒性控制提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥器（上海一恒科技有限公司）；RE-52AA 型金葉牌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Thermo Fisher U3000 型高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.2 試藥與試劑

苯甲酰新烏頭原堿對照品（批號：111795-201604）、苯甲酰烏頭原堿對照品（批號：111794-201705）、苯甲酰次烏頭原堿對照品（批號：111796-201705)；新烏頭堿對照品（批號：DST191015-025）、烏頭堿對照品（批號：DST200330-006)、次烏頭堿對照品（批號：DST200318-058）均購自德思特生物科技有限公司。生附片藥材（由神威藥業(yè)集團有限公司提供）。乙腈、甲醇、磷酸（Fisher 公司，色譜級），甲酸（天津市大茂化學試劑廠，色譜級），純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），其它試劑為分析級。

附片藥材采自陜西漢中、四川江油、陜西安州，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品。

2 方法

2.1 砂燙附片的制備

將電陶爐調(diào)至2 200 W，熱鍋，用紅外線測溫儀測鍋邊與鍋底的溫度，均達到200 ℃時，投入 10倍量潔凈河砂，當砂溫達到 250 ℃時，將功率調(diào)至1 400 W（約240 ℃），投入大小分檔的生附片 100 g，不斷翻炒，至飲片內(nèi)外皆黃，且表面出現(xiàn)裂隙時取出。

2.2 附片中生物堿含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件的建立 色譜柱Shiseido Capcell PAK C18MG S-5（4.6 mm × 250 mm）；流動相為乙腈（A）-40 mmol/L（B）醋酸銨溶液（加氨水調(diào)pH 約至9.5），洗脫梯度見表1；檢測波長為240 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣體積為10 μL；生附片、砂燙附片與對照品的圖譜見圖1。

表1 附片中生物堿含量測定的洗脫梯度Tab. 1 Elution gradients of alkaloid content determination in aconite slices

圖1 生附片與砂燙附片中生物堿含測的HPLC 圖譜Fig. 1 Mapping of raw and sanded aconite slices

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取苯甲酰新烏頭原堿5.03 mg，苯甲酰烏頭原堿5.02 mg，苯甲酰次烏頭原堿5.02 mg 三種單酯型生物堿至25 mL容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷定容，搖勻后，精密吸取0.5 mL 溶液至10 mL 容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷定容，即得。分別精密稱取新烏頭堿12.66 mg，烏頭堿12.57 mg，次烏頭堿12.57 mg 三種雙酯型生物堿至10 mL 容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷定容，搖勻后，精密吸取1 mL 溶液至10 mL容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷定容，搖勻后，再精密吸取1 mL 溶液至25 mL 容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷定容，即得。再分別稱取六種生物堿對照品適量至容量瓶中，加甲醇溶解后，作為用來定性的混合對照品溶液（濃度約1 mg/mL）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取砂燙附片粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1 ∶1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率：300 W，頻率：40 kHz，水溫在25 ℃以下）30 min，放冷，補重，搖勻，濾過。精密移取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-二氯甲烷（1 ∶1）混合溶液3 mL，濾過，取續(xù)濾液，即得[6]。

2.3 附片水煎液特征圖譜的建立

2.3.1 色譜條件的建立 色譜柱Thermo AcclaimTM 120-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），洗脫梯度見表2；檢測波長為230 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣體積為20 μL。生附片水煎液和砂燙附片水煎液的特征圖譜見圖2。

表2 附片水煎液特征圖譜的流動相洗脫梯度Tab. 2 Elution gradient of mobile phase in characteristic map of aconite slices decoction

圖2 生附片水煎液和砂燙附片水煎液的特征圖譜Fig. 2 Characteristic maps of the water decoction of raw and sanded aconite slices

2.3.2 供試品溶液的制備 將生附片、砂燙附片分別切成規(guī)格基本相同的片或小塊，精密稱取各藥材2.5 g 于250 mL 圓底燒瓶中，精密加入100 mL 水，加熱回流70 min，過濾后放冷，調(diào)整體積至100 mL。精密移取1 mL 續(xù)濾液，稀釋1 倍，將稀釋水溶液離心后（10 000 r/min，5 min），取上清液濾過，即得。

2.3.3 特征圖譜處理方法 將圖譜數(shù)據(jù)以cdf.的格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件，對前11 min 的色譜峰進行剪切，設(shè)置時間窗寬度為0.1、以保留時間為30.8 min 的峰為參照，進行峰匹配，計算相似度結(jié)果。

2.3.4 方法學考察 取供試品溶液按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，按照“2.3.3”項處理，結(jié)果相似度R 均大于0.98，說明該儀器精密度良好；取同一批樣品，按“2.3.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，按照“2.3.3”處理，結(jié)果相似度R 均大于0.98，說明該方法重復性良好；取供試品溶液放置 0、3、6、9、12、24 h后按“2.3.1”項下色譜條件測定，按照“2.3.3”處理，結(jié)果相似度R 均大于0.98，說明測定的樣品在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.4 統(tǒng)計學方法

用SAS 8.2 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 附片中生物堿含量測定

按照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，以隨行標品作對照，分別測定生附片和砂燙附片中三種單酯型生物堿、三種雙酯型生物堿的含量。附片炮制前后三種單酯型生物堿含量見表3。由表3 可知，生附片三種單酯型生物堿含量平均值均小于砂燙附片含量平均值，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），單酯型生物堿是附片中的有效成分，因此可說明砂燙有增效的作用。

生附片與砂燙附片中雙酯型生物堿的含量測定結(jié)果如表4 所示，生附片雙酯型生物堿的含量均高于砂燙附片含量平均值，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），可能是由于炮制后雙酯型生物堿被破壞的原因。由于雙酯型生物堿為毒性成分，因此可說明砂燙能減毒。

3.2 附片水煎液特征圖譜的測定

分別吸取三個產(chǎn)地附片生品、炮制品供試品溶液適量，按“2.3.1”項下色譜條件測定，按照“2.3.3”項處理，根據(jù)多批次樣品色譜圖的共有模式生成生品對照圖譜與炮制品對照圖譜，計算三個產(chǎn)地各批次附片特征圖譜與對照圖譜的相似度并計算均值，結(jié)果見表5，生附片和砂燙附片的相似度均大于0.80。三個產(chǎn)地附片炮制前后的特征圖譜沒有顯著性差異（P ＞0.05），說明炮制對其影響不大。三個產(chǎn)地生附片間的特征圖譜也無顯著性差異（P ＞0.05），說明均一性較好。

3.3 附片出膏率的測定

取“2.3.2 ”項下剩余的供試品溶液，加熱濃縮成稠膏狀，60 ℃減壓干燥至恒重，稱定干膏重量，按出膏率=干膏重/取樣量×100%計算。結(jié)果見表6，從表中看出，同一產(chǎn)地的生附片、砂燙附片出膏率值都較為接近，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），說明炮制對出膏率影響不大。三個產(chǎn)地生附片間的出膏率比較，以及三個產(chǎn)地砂燙附片間的出膏率比較，均無顯著性差異（P ＞0.05），說明這三個產(chǎn)地的砂燙附片的出膏率均一性較好。

表3 生附片與砂燙附片中單酯型生物堿的含量測定結(jié)果（±s）Tab. 3 Content determination results of monoester alkaloids of raw and sanded aconite slices （±s）

表3 生附片與砂燙附片中單酯型生物堿的含量測定結(jié)果（±s）Tab. 3 Content determination results of monoester alkaloids of raw and sanded aconite slices （±s）

d±sd 配對t P陜西漢中 4 苯甲酰新烏頭原堿/% 0.012 9 ± 0.003 1 0.029 6 ± 0.007 3 0.016 7 ± 0.006 1 -7.78 0.000 1苯甲酰烏頭原堿/% 0.001 8 ± 0.000 6 0.005 5 ± 0.002 8 0.003 7 ± 0.003 3 -3.16 0.015 8苯甲酰次烏頭原堿/% 0.000 6 ± 0.000 4 0.006 6 ± 0.002 5 0.006 0 ± 0.002 7 -6.26 0.000 4總含量/% 0.015 3 ± 0.002 8 0.041 7 ± 0.012 1 0.026 4 ± 0.010 9 -6.84 0.000 2四川江油 6 苯甲酰新烏頭原堿/% 0.011 1 ± 0.002 8 0.020 5 ± 0.017 5 0.009 3 ± 0.014 6 -2.20 0.049 7苯甲酰烏頭原堿/% 0.003 2 ± 0.001 9 0.008 9 ± 0.001 7 0.005 6 ± 0.002 4 -8.07 0.000 1苯甲酰次烏頭原堿/% 0.002 3 ± 0.000 3 0.009 6 ± 0.002 6 0.007 3 ± 0.002 8 -9.03 0.000 1總含量/% 0.016 7 ± 0.004 6 0.039 0 ± 0.016 2 0.022 2 ± 0.016 2 -4.76 0.000 6陜西安州 5 苯甲酰新烏頭原堿/% 0.018 5 ± 0.005 9 0.051 7 ± 0.019 4 0.033 1 ± 0.024 2 -4.34 0.001 0苯甲酰烏頭原堿/% 0.002 0 ± 0.000 7 0.010 5 ± 0.003 7 0.008 5 ± 0.004 0 -6.67 0.000 1苯甲酰次烏頭原堿/% 0.003 1 ± 0.001 0 0.011 4 ± 0.003 8 0.008 3 ± 0.003 7 -7.14 0.000 1總含量/% 0.023 6 ± 0.006 0 0.073 6 ± 0.020 4 0.050 0 ± 0.025 9 -6.11 0.000 2產(chǎn)地 n 類別 生附片 砂燙附片

表4 生附片與砂燙附片中雙酯型生物堿的含量測定結(jié)果（±s）Tab. 4 Content determination results of diester alkaloids of raw and sanded aconite slices（±s）

表4 生附片與砂燙附片中雙酯型生物堿的含量測定結(jié)果（±s）Tab. 4 Content determination results of diester alkaloids of raw and sanded aconite slices（±s）

d±sd 配對t P陜西漢中 4 新烏頭堿/% 0.058 0 ± 0.028 1 0.000 2 ± 0.000 3 0.057 8 ± 0.028 3 5.77 0.000 7烏頭堿/% 0.010 6 ± 0.006 4 0.000 0 ± 0.000 0 0.015 4 ± 0.006 4 4.71 0.002 2次烏頭堿/% 0.027 4 ± 0.005 8 0.001 0 ± 0.000 6 0.026 4 ± 0.005 4 13.82 0.000 1總含量/% 0.096 0 ± 0.037 4 0.001 2 ± 0.000 8 0.038 2 ± 0.010 3 7.14 0.000 2四川江油 6 新烏頭堿/% 0.039 5 ± 0.010 5 0.000 0 ± 0.000 0 0.039 5 ± 0.010 5 13.02 0.000 1烏頭堿/% 0.015 4 ± 0.005 8 0.000 1 ± 0.000 2 0.015 4 ± 0.005 8 9.25 0.000 1次烏頭堿/% 0.030 0 ± 0.009 8 0.007 8 ± 0.009 2 0.022 3 ± 0.006 9 11.17 0.000 1總含量/% 0.085 0 ± 0.020 5 0.007 8 ± 0.009 2 0.045 5 ± 0.011 1 15.91 0.000 1陜西安州 5 新烏頭堿/% 0.024 3 ± 0.005 4 0.000 7 ± 0.000 6 0.023 5 ± 0.005 9 12.65 0.000 1烏頭堿/% 0.004 5 ± 0.002 1 0.000 1 ± 0.000 1 0.004 4 ± 0.002 0 6.76 0.000 1次烏頭堿/% 0.022 3 ± 0.007 9 0.0003 ± 0.0009 0.022 0 ± 0.007 7 9.04 0.000 1總含量/% 0.051 0 ± 0.001 8 0.0012 ± 0.0009 0.027 5 ± 0.006 6 87.97 0.000 1產(chǎn)地 n 類別 生附片 砂燙附片

表5 附片的特征圖譜相似度結(jié)果（±s）Tab. 5 Similarity evaluation results of aconite slices（±s）

表5 附片的特征圖譜相似度結(jié)果（±s）Tab. 5 Similarity evaluation results of aconite slices（±s）

產(chǎn)地 n 生附片 砂燙附片 t P陜西漢中 4 0.864 ± 0.04 0.859 ± 0.08 0.10 0.930 2四川江油 6 0.884 ± 0.05 0.859 ± 0.06 0.74 0.493 7陜西安州 5 0.910 ± 0.05 0.855 ± 0.08 1.85 0.137 3 F 1.48 0.01 0.266 3 0.990 8 P

表6 附片的出膏率結(jié)果（±s）Tab. 6 Paste yield results of aconite slice（±s）

表6 附片的出膏率結(jié)果（±s）Tab. 6 Paste yield results of aconite slice（±s）

產(chǎn)地 n 生附片 砂燙附片 t P陜西漢中 4 16.17 ± 0.68 17.13 ± 1.30 -1.52 0.225 2四川江油 6 17.66 ± 1.64 18.49 ± 2.03 -1.07 0.331 8陜西安州 5 18.28 ± 1.77 17.43 ± 1.92 0.75 0.497 2 F 2.25 0.78 0.147 5 0.478 6 P

3.4 附片炮制前后的質(zhì)量屬性變化分析

附子為有毒中藥，其質(zhì)量關(guān)系臨床用藥安全，因此炮制方法是否既能降低其毒性，又能增加其有效作用就顯得十分重要。本研究采用HPLC 分別測定生附片和砂燙附片中的生物堿含量并運用統(tǒng)計學方法進行炮制前后的量值變化分析，結(jié)果顯示經(jīng)砂燙后單酯型生物堿含量顯著提高，雙酯型生物堿含量顯著降低。分析其因炮制后雙酯型生物堿中的新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿分別水解為單酯型生物堿中的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿，雙酯型生物堿完全被破壞，單酯型生物堿含量增加。雙酯型生物堿是烏頭類生物堿的大毒成分, 而單酯型生物堿毒性遠低于雙酯型生物堿，具有較好的藥理作用，雙酯型烏頭堿類成分經(jīng)水解轉(zhuǎn)變單酯型烏頭堿類成分, 毒性大大降低，因此砂燙附片可以減毒增效；通過建立附片水煎液特征圖譜的方法來考察生附片、砂燙附片的水煎液特征圖譜及出膏率，并運用統(tǒng)計學方法對炮制前后的特征圖譜及出膏率進行比較，結(jié)果顯示附片炮制前后的特征圖譜無顯著性差異，炮制前后的出膏率無顯著性差異，說明炮制對附片的特征圖譜及出膏率沒有影響。

砂燙法炮制附片后質(zhì)量屬性較為穩(wěn)定，炮制后起到減毒增效的作用。生附片到砂燙附片的量值變化關(guān)系中：特征圖譜沒有明顯變化；出膏率沒有明顯變化；單酯型生物堿顯著增加、雙酯型生物堿顯著減少。本次實驗中使用的附片產(chǎn)地為四川省和陜西省，是附片的主產(chǎn)區(qū)，其含量符合《中國藥典》標準，更增加了實驗結(jié)果的可靠性。

4 討論

4.1 砂燙法的溫度確定

古書中記載以“內(nèi)外皆黃”“坼”為炮附片外觀性狀標準。根據(jù)古書中的標準，以炮制后的色澤、性狀、質(zhì)地為指標，確定砂燙法炮制過程中的最合適溫度。在實驗室小試工藝中，通過控制加熱功率調(diào)節(jié)砂燙法溫度。在 2 200 W 功率下熱鍋，可快速達到200 ℃；在砂溫達到 250 ℃時，用1 000 W（約223 ℃）需炮制5 min 左右，其斷層內(nèi)有白心且已經(jīng)出現(xiàn)焦的趨勢；用1 400 W（約240 ℃）炮制需4 ～ 4.5 min左右，其質(zhì)地酥脆，內(nèi)外皆黃，整體色澤勻稱；用1 800 W （258 ℃）炮制時溫度較高，難以把控火候，3.5 min 左右就有焦的趨勢。通過對比不同溫度炮制后的外觀性狀可以得出，當砂溫達到 240 ℃，即電陶爐功率調(diào)至1 400 W 時，生附片炮制的效果最好，外觀性狀最接近古書中記載的標準。

4.2 砂燙附片與其它品種附片的差異性

2020 版《中國藥典》收載了鹽附子、黑順片、白附片[6]?！吨袊幍洹分械母阶优谥破肪捎媚懓突蚴雏}炮制，它們都屬于水制法。《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》收載有炒附片：“將中等細度的砂投入炒藥機內(nèi)，炒至滑利，投入生附片，砂炒至外表皮黃棕色，斷面黃色，取出，迅速篩去砂子，晾涼[7]”，其規(guī)定“炒附片為不規(guī)則的片，厚2 ～ 5 mm，外表皮黃棕色，切面淺黃色至黃棕色，質(zhì)松脆，氣香，味微苦，微有麻舌感”。本實驗在此標準的基礎(chǔ)上，明確了砂燙附片具體的炮制參數(shù)。

在不同炮制品生物堿的含量比較中，《中國藥典》中只有黑順片的單酯型生物堿的總含量增加，而其它規(guī)格的炮制品反而無變化或有所下降。對其中的雙酯型生物堿到單酯型生物堿的轉(zhuǎn)化量進一步研究發(fā)現(xiàn)[8]：新烏頭堿完全水解成醇胺類生物堿，無法轉(zhuǎn)化為苯甲酰新烏頭原堿，即轉(zhuǎn)化率為0；烏頭堿水解成苯甲酰烏頭原堿的轉(zhuǎn)化率最多為21.1%；次烏頭堿水解成苯甲酰次烏頭原堿的轉(zhuǎn)化率最多為11.4%，而炒制法中相對應成分的轉(zhuǎn)化率分別為31.3%、32.0%、46.1%，由此說明炒附片能降毒存效。這與本實驗中的砂燙附片效果相同，均能增加單酯型生物堿含量，降低雙酯型生物堿含量，起到降毒存效的作用。附子道地產(chǎn)區(qū)是四川，所以在地方炮制規(guī)范中有炒附片的記載，《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》中規(guī)定炒附片中單酯型生物堿的總含量應為0.010% ～0.130%，本實驗中的砂燙附片均達到標準。

5 結(jié)論

本研究對附片的炮制方法進行研究，并建立了附片中生物堿成分的含量測定方法和水煎液的特征圖譜。應用砂燙法進行炮制并從其炮制后的生物堿含量、水煎液特征圖譜、出膏率三個方面進行質(zhì)量屬性的評價，同時分析附片炮制前后的量值變化關(guān)系，證明其炮制后質(zhì)量屬性穩(wěn)定，起到了減毒增效的作用，對今后附片的毒性控制及臨床研究有一定幫助，后期本實驗還可以在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進行附片藥理學方面的研究來進一步佐證其質(zhì)量屬性與療效的關(guān)系。