張鑫慧 楊亭 陳潔 陳立 代英 賈飛勇 武麗杰 郝燕 李玲 張婕柯曉燕 衣明紀(jì) 洪琦 陳津津0 方拴鋒 王益超 王琦 金春華 李廷玉

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗室/兒童營養(yǎng)與健康重慶市重點(diǎn)實(shí)驗室，重慶 400014；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院發(fā)育行為兒科，吉林長春130031；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱 150001；4.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒童保健科，湖北武漢 430030；5.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心兒童保健部，海南?？?570206；6.西安市兒童醫(yī)院兒童保健中心，陜西西安 710003；7.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院，江蘇南京 210000；8.青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒童保健科，山東青島 266000；9.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東深圳 518000；10.上海市兒童醫(yī)院兒童保健科，上海 200000；11.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童保健科，河南鄭州 450018；12.湖南省婦幼保健院，湖南長沙 410008；13.德陽市婦幼保健院，四川德陽 618000；14.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院保健科，北京 100020）

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder,ASD）是一組以社會交往障礙、重復(fù)刻板行為和興趣狹窄為主要特征的神經(jīng)發(fā)育性障礙疾病[1‐2]。ASD兒童的患病率逐年上升，最新文獻(xiàn)報道美國8歲兒童中ASD的患病率是1/54[3]，國內(nèi)6~12歲兒童中ASD的患病率為0.7%[4]。多數(shù)研究表明遺傳、環(huán)境和免疫因素在ASD的病因中發(fā)揮著重要作用[5‐8]，但其機(jī)制尚未闡明。研究表明營養(yǎng)素是一種重要的環(huán)境因子，可能與ASD的發(fā)病有關(guān)[9]。

與正常兒童相比，ASD兒童存在更多的進(jìn)食行為問題，主要表現(xiàn)在挑食、偏好某種食物及刻板的進(jìn)食行為等方面，因此ASD兒童更容易出現(xiàn)營養(yǎng)素的缺乏[10]。微量元素在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和主要功能方面起著重要作用，此外，與人體免疫系統(tǒng)、生長發(fā)育和智能發(fā)育等密切相關(guān)[11‐13]。國內(nèi)外研究顯示，ASD兒童的血清鈣、鋅、鐵水平顯著低于正常兒童[14‐16]。但也有研究報道ASD兒童的鐵含量顯著高于對照組[17]。這些研究結(jié)果不一，可能是由于樣本量較小，納入的研究對象局限于單一地區(qū)，代表性較欠缺。此外，對于ASD兒童的微量元素水平與核心癥狀的相關(guān)性研究，國內(nèi)尚未報道。因此，本研究通過全國多中心、大樣本調(diào)查探討ASD兒童與正常兒童常見微量元素鎂、鐵、銅、鋅血清水平的差異，并進(jìn)一步探討其水平與ASD兒童核心癥狀的相關(guān)性，為臨床監(jiān)測和干預(yù)ASD兒童的營養(yǎng)狀況提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象來自“全國孤獨(dú)癥譜系障礙兒童營養(yǎng)規(guī)范管理多中心研究”。該項目已獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)（批號：121‐1/2018），并在中國臨床試驗中心（http://www.chictr.org.cn/index.aspx）注冊（ChiCTR2000031194），所有參與本研究的兒童家長均已簽署知情同意書。

樣本量的計算：按兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的研究設(shè)計計算樣本量。鎂、鐵、銅、鋅的均值和標(biāo)準(zhǔn)差均參考既往文獻(xiàn)里的相應(yīng)數(shù)值[15,18]，取α=0.05，1‐β=0.9，應(yīng)用 PASS 11軟件進(jìn)行計算，得出每組所需樣本量為475例。

2018年9月至2019年9月在中國13個城市三級甲等醫(yī)院門診和特殊教育機(jī)構(gòu)招募2~7歲1 342名ASD兒童和1 293名正常兒童，最初總共納入2 635名兒童。其中165名兒童未收集到血清標(biāo)本，并對兒童進(jìn)行性別、年齡的匹配，最終納入1 020名ASD兒童（ASD組）和1 038名正常兒童（對照組）。13個城市來自中國的東部（上海和南京）、西部（重慶、德陽和西安）、南部（深圳、海口和長沙）、北部（哈爾濱、青島和長春）和中部（武漢和鄭州）地區(qū)。調(diào)查對象納入流程見圖1。

ASD組：由兩位臨床經(jīng)驗豐富的發(fā)育行為及兒童保健科醫(yī)師根據(jù)《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊》（DSM‐5）[19]對患兒進(jìn)行ASD確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腦損傷；（2）嚴(yán)重軀體和感覺障礙（盲、聾）；（3）獨(dú)立的神經(jīng)發(fā)育障礙疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾??；（4）其他急慢性疾?。唬?）過去半年內(nèi)使用過營養(yǎng)素補(bǔ)充劑。

對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）發(fā)育行為障礙性疾病、神經(jīng)精神?。唬?）先天性疾病、急慢性感染性疾病等；（3）食物或藥物過敏；（4）過去半年內(nèi)使用過營養(yǎng)補(bǔ)充劑；（5）嚴(yán)重營養(yǎng)不良。

圖1 調(diào)查對象納入流程圖

1.2 血清微量元素的測定

在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血2~3 mL置于紅頭管中，常溫放置1~2 h或在37℃水浴條件下放置0.5~1 h，然后用高速離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，取0.7 mL上層血清放入普通EP管中，統(tǒng)一用干冰運(yùn)輸?shù)奖本┖秃厢t(yī)學(xué)檢驗所有限公司進(jìn)行檢測。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法[20]測量血清鎂、鐵、銅、鋅的濃度，檢測儀器的型號是API3200（美國）。

1.3 孤獨(dú)癥行為量表

孤獨(dú)癥行為量表（Autism Behaviour Checklist,ABC）[21]適用于8個月至28歲ASD患者的篩查和輔助診斷，由家長填寫。該量表包括57項ASD兒童的行為癥狀表現(xiàn)，歸納為感覺能力、交往能力、軀體運(yùn)動能力、語言、生活自理5個因子。每項分別評分1、2、3、4分共4個等級?？偡帧?3分作為ASD篩查界限分，總分≥67分作為ASD陽性界限分。

1.4 社交反應(yīng)量表

社交反應(yīng)量表（Social Responsiveness Scale,SRS）[22]用于評估4~18歲ASD兒童的日常社交情況，由家長填寫。該量表包括65個項目，由社交知覺、社交認(rèn)知、社交溝通、社交動機(jī)及孤獨(dú)癥行為方式等5個分項組成。每個項目包含1、2、3、4分共4個等級評分?？偡郑?5分為ASD篩查陽性。

1.5 孤獨(dú)癥評定量表

孤獨(dú)癥評定量表（Childhood Autism Rating Scale, CARS）[21]適用于2歲以上ASD兒童的癥狀評估，包括15個項目。由經(jīng)過培訓(xùn)的人員進(jìn)行評估，每項包含1、2、3、4分4個等級評分。若總分為30~36分，且低于3分的項目不到5項，提示輕-中度ASD；若總分＞36分且至少5項的評分高于3分，提示重度ASD。

1.6 質(zhì)量控制

調(diào)查前對研究人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)，統(tǒng)一調(diào)查方法和標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)錄入采用雙錄入法，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)性檢驗用 Kolmogorow‐Smirnov方法，符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示。符合正態(tài)分布且方差齊的兩組間數(shù)據(jù)的比較采用兩樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料兩組間的比較采用Mann‐WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和百分率[n（%）]表示，兩組間計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。采用偏相關(guān)分析法（控制年齡和性別兩個變量）評估血清微量元素水平與ABC和SRS量表評分的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

ASD組共1 020名兒童，年齡2~7歲，男性占76.57% （781/1 020） ；對照組1 038名兒童，年齡2~7歲，男性占76.20%（791/1 038）。兩組性別、年齡的比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 ASD組和對照組血清微量元素水平的比較

ASD組兒童血清鎂、銅、鋅水平明顯低于對照組（均P＜0.05），而兩組血清鐵水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 不同程度ASD兒童血清微量元素水平的比較

重度ASD兒童血清鎂和鋅水平顯著低于輕-中度ASD兒童（均P＜0.05），見表3。

2.4 血清微量元素水平與ABC和SRS量表得分的相關(guān)性

偏相關(guān)分析顯示，ASD兒童的各血清微量元素水平與SRS量表總分及各分項得分均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。血清鎂水平與ABC量表總分和交往能力得分均呈負(fù)相關(guān)（分別r=-0.318，P＜0.001；r=-0.282，P＜0.001）；血清鋅水平與ABC量表總分、交往能力得分及軀體運(yùn)動得分均呈負(fù)相關(guān)（分別r=-0.221，P＜0.001；r=-0.270，P＜0.001；r=-0.207，P＜0.001）。見表4。

表1 ASD組和對照組的基本資料

表2 ASD組和對照組血清微量元素水平的比較 [M（P25，P75），mg/L]

表3 輕-中度和重度ASD兒童血清微量元素水平的比較 [M（P25，P75），mg/L]

表4 ASD兒童的血清微量元素水平與SRS和ABC量表得分的相關(guān)性

續(xù)表4

3 討論

ASD病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚。微量元素作為酶的輔助因子，在調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能方面發(fā)揮著重要作用。鋅、銅等微量元素在維持神經(jīng)系統(tǒng)功能中起著重要作用，在人體中其含量過低或過高可能會導(dǎo)致發(fā)育障礙的發(fā)生。據(jù)文獻(xiàn)報道，兒童體內(nèi)銅、鋅和硒等微量元素水平的穩(wěn)態(tài)失調(diào)，可能會增加ASD兒童的患病風(fēng)險[23‐25]。本研究通過全國多中心、大樣本調(diào)查探討ASD兒童常見微量元素鎂、鐵、銅、鋅的血清水平，并采用ABC、SRS、CARS量表對ASD兒童的核心癥狀進(jìn)行評估，探討ASD兒童常見微量元素與其核心癥狀間的聯(lián)系，為臨床干預(yù)提供依據(jù)。

本研究對ASD組和對照組兒童的血清微量元素水平進(jìn)行比較時，發(fā)現(xiàn)ASD兒童的血清鎂、銅、鋅水平顯著低于對照組。Wu等[15]和Cr?ciun等[26]研究也發(fā)現(xiàn)ASD兒童的血清鋅水平顯著低于正常兒童，本研究結(jié)果與之相一致。ASD兒童鋅缺乏可能是多種因素造成的，其具體機(jī)制尚未研究清楚，可能是由于ASD兒童特殊的飲食行為問題，比如挑食、拒絕嘗試新的食物等[10]，引起鋅攝入量不足。本研究結(jié)果表明，ASD兒童的血清鎂水平顯著低于正常兒童，姚梅玲等[18]對50例ASD兒童全血中微量元素含量進(jìn)行分析時也得到了同樣的結(jié)果。此外，Saghazadeh等[16]對ASD兒童微量元素水平進(jìn)行Meta分析時，其研究結(jié)果也表明ASD患者血清鎂水平低于對照組。Skalny等[27]對ASD兒童體內(nèi)鎂含量的一項研究中，提出頭發(fā)和尿液中的鎂含量可能是神經(jīng)發(fā)育性障礙的重要預(yù)測指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)ASD兒童血清銅水平明顯低于正常兒童，與Skalny等[17]的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)重度ASD兒童的血清鎂、鋅水平明顯低于輕-中度ASD兒童，提示低水平的鎂、鋅可能會加重ASD兒童的嚴(yán)重程度。Fiore等[28]的研究也發(fā)現(xiàn)鋅與ASD兒童的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。一項關(guān)于印度ASD兒童隊列的研究結(jié)果表明，頭發(fā)中的鎂含量與ASD嚴(yán)重程度呈反比關(guān)系[29]。此外，本研究對ASD兒童血清微量元素水平與核心癥狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清鎂水平與ABC量表總分、交往能力得分呈負(fù)相關(guān)，血清鋅水平與ABC量表總分、交往能力得分及軀體運(yùn)動得分呈負(fù)相關(guān)，提示鎂、鋅可能與ASD兒童的核心癥狀有關(guān)。研究表明鋅在維持大腦正常功能中發(fā)揮著重要作用，主要參與神經(jīng)元的形成、遷移和分化。此外，鋅可能會影響神經(jīng)元的興奮性突觸活動，引起ASD兒童出現(xiàn)相關(guān)的行為異常[25]。鎂在維持大腦的功能作用和調(diào)節(jié)情緒中起著關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是參與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元成熟的重要因素[30]。并涉及數(shù)百種酶促反應(yīng)，參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，以及調(diào)節(jié)5‐羥色胺、多巴胺和膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞[31]。相關(guān)研究表明低鎂水平可能導(dǎo)致γ‐氨基丁酸能信號受損，增加ASD的發(fā)病風(fēng)險[16]。

本研究是一個全國多中心大樣本的研究，最初收集到2 615例樣本，由于部分兒童，尤其ASD兒童抽血時不配合導(dǎo)致樣本出現(xiàn)溶血情況，致使15%樣本損失；另外，我們并未研究其他微量元素對ASD兒童的影響，例如硒、錳、鈷等元素。本研究是基于一個全國多中心研究的部分內(nèi)容，通過大樣本的橫斷面調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ASD兒童的血清鎂、銅、鋅含量較低，血清鎂和鋅水平與ASD兒童的核心癥狀具有一定關(guān)聯(lián)，但這種關(guān)聯(lián)的意義需要進(jìn)一步研究。臨床上應(yīng)注意監(jiān)測ASD兒童的微量元素營養(yǎng)狀況，有針對性地進(jìn)行個體干預(yù)。