卞偉妮，吳新婷

（西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，陜西 西安710038）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是圍生期新生兒發(fā)生窒息后產生的嚴重并發(fā)癥，可造成新生兒神經系統(tǒng)腦水腫和腦壞死[1]。臨床研究顯示，約50%的腦癱患兒是由HIE 引起的。引發(fā)HIE 原因較多，如母體妊娠高血壓、胎盤異常、胎盤早剝、胎兒發(fā)育遲緩、臍帶脫落、分娩中出現臍帶繞頸和打結等[2]。因此，發(fā)現新的生物學標志物用于早期診斷HIE及預測HIE 的預后顯得尤為重要[3-4]。

MicroRNA 是一條具有20～25 個核苷酸序列的內源性非編碼RNA，廣泛參與到器官發(fā)育，細胞增殖、分化、遷移和凋亡，腫瘤發(fā)生及代謝等各種生理病理過程[5-7]。本實驗通過檢測血清microRNA-21（miR-21）在HIE 患兒和正常新生兒之間的表達差異，以及與腦功能評分（NBNA）的關系，以探究miR-21 在HIE 診斷和預后預測的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年3月—2019年6月西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院新生兒HIE 患兒56 例（HIE 組）。其中，男性31 例，女性25 例；剖宮產20 例，順產36 例；胎齡38～40 周，平均（39.1±0.8）周；出生體重2 750～4 100 g，平均（3 219.7±251.6）g。納入標準：符合世界衛(wèi)生組織制定的新生兒缺氧缺血性腦病的診斷標準[8]；母體妊娠期間無其他并發(fā)癥；出生體重2 630～4 000 g；胎齡37～42 周。排除標準：先天性病變引發(fā)的腦損傷者；伴有顱內出血、宮內窘迫因素引發(fā)的感染和抽搐；對本研究結果會產生影響的感染性病變、肝腎功能障礙者。同時選取健康新生兒60 例為對照組。其中男性28 例，女性32 例；剖宮產22 例，順產38 例；胎齡38～40 周，平均（39.0±0.6）周；出生體重2 600～4 215 g，平均（3 180±247.2）g。

1.2 研究對象血液樣本采集

HIE 組在出生后24 h（急性期）、7 d（恢復期）分別采集2 ml 股靜脈血；對照組于出生后24 h采集2 ml 股靜脈血。血液樣品于常溫下放置1 h 后3 000 r/min 離心20 min，取上層1 ml 血清至EP 管中，于-80℃冰箱冷凍保存。

1.3 試劑

RNAsimple 總RNA 提取試劑盒（DP419）購自天根（北京）生物科技有限公司，PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息見表1。實時定量PCR 試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。實時定量PCR 儀購自美國Bio-Red 公司。置入-80℃冰箱冷凍保存（購自美國Thermo Fisher公司）。

表1 引物序列

1.4 實時熒光定量PCR檢測miRNA的表達

通過總RNA 提取試劑盒提取血液樣本中的總RNA，進行擦除DNA 和逆轉錄操作，得到cDNA 用于逆轉錄，按照PCR 試劑盒說明書配制逆轉錄體系。實時熒光定量PCR 采取二步法，條件如下：95℃預變性30 s；PCR 反應，95℃預變性5 s，60℃變性30 s。共循環(huán)40 次。通過2-ΔΔCt法檢測miR-21的表達水平。

1.5 新生兒神經行為測定

出生后30 d 對兩組新生兒進行新生兒神經行為測定（neurobehavioral measurement in neonates,NBNA）[9]，包括27 項行為能力和20 項神經反射，總分40 分，評分越高表明新生兒神經功能越好。

1.6 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Pearson 法，繪制ROC 曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較

兩組性別構成、生產方式、體重、胎齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組一般情況的比較

2.2 兩組血清miR-21表達水平的比較

在HIE 發(fā)生的急性期（出生后24 h），HIE 組患兒血清miR-21 表達水平與對照組新生兒比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.470，P=0.000），HIE 組患兒血清miR-21 表達水平（1.857±0.136）高于對照組新生兒（0.826±0.127）。見圖1。

圖1 血清miR-21表達水平的比較

2.3 急性期miR-21表達的診斷學意義

通過繪制miR-21在兩組血清中表達水平的ROC曲線，評價miR-21 對新生兒HIE 的診斷效能。ROC曲線下面積以0.5作為參考界值，miR-21表達水平對HIE 預測的ROC曲線下面積為0.758 （95% CI：67.32，85.78）。結果提示，血清miR-21 的表達水平對診斷新生兒HIE具有較高的診斷價值。見圖2。

圖2 miR-21診斷新生兒HIE的ROC曲線

2.4 恢復期miR-21表達水平與NBNA的相關性分析

新生兒HIE患兒治療7 d時miR-21血清表達水平與恢復30 d 時NBNA 評分呈負相關（r=-0.746，P=0.000）。見圖3。

圖3 恢復期miR-21與NBNA評分的相關性

3 討論

近年來隨著居民生活水平的提高，產前和新生兒護理條件得到顯著改善。但HIE 仍然是全世界新生兒發(fā)病和死亡的重要原因[10]。新生兒HIE 并非罕見病，在新生兒中的發(fā)病率約為2‰～3‰。在一些發(fā)展中國家，其發(fā)生頻率甚至可上升到26‰。這些HIE 患兒中約24%在急性期死亡；其余存活的新生兒中，也會伴隨腦癱（10%～20%），視覺和聽覺障礙（約40%）以及運動和行為損害，例如癲癇，整體發(fā)育遲緩和自閉癥等后遺癥[11-12]。HIE 對社會和家庭帶來了巨大的經濟和心理負擔，現在已有大量的研究聚焦HIE 的診斷、干預和治療。

HIE 可以發(fā)生于產前，圍生期或產后等各個時期，呈急性或慢性發(fā)展[13]。在損傷的潛伏期（1～6 h），發(fā)生氧化代謝、炎癥和凋亡級聯反應的激活。HIE損傷后6～48 h，發(fā)生高能磷酸化合物的消耗以及興奮性神經遞質和自由基的釋放[14-15]。在急性缺血長達1 個月后，發(fā)生晚期細胞死亡，受傷的大腦重塑和星形膠質細胞的增生[16-18]。HIE 的基本病理過程包括：線粒體損傷、自由基生成、一氧化氮合成酶（NOS）的激活、炎癥反應、神經元細胞凋亡。

MicroRNA（miRNA）是由基因組內的短反向重復編碼的約22 個核苷酸的內源非編碼單鏈RNA[19]。第一個miRNA，lin-4，于1993年在線蟲中被發(fā)現。脊椎動物中miRNA 的存在于2001年得到證實。目前，已有超過800 種miRNA 在人類中被克隆和測序，并且人類基因組中miRNA 基因的估計數量高達1 000。miR-21 由單個基因編碼，在各種脊椎動物物種中表現出強大的進化保守性[20]。

本研究發(fā)現，miR-21 在新生兒HIE 急性期大量表達，可作為新生兒HIE 的早期標志物，為HIE的診斷提供新的生物學標志物。而在HIE 恢復期，給予常規(guī)治療的HIE 患兒，發(fā)病后7 d 的miR-21 表達水平與發(fā)病30 d 后NBNA 評分呈負相關，說明恢復早期miR-21 水平對HIE 患兒后期神經功能恢復具有預測作用，為HIE 的后期康復治療提供重要依據。miR-21 的生物學作用在腫瘤研究中得到了很好的證實。實際上，已發(fā)現miR-21 在多種腫瘤組織中過表達，同時miR-21 可作為胰腺癌、結腸癌等多種癌癥的生物學標志物。在免疫系統(tǒng)，miR-21可通過介導Th17 細胞分化參與多種自身免疫性疾病的發(fā)展[20-22]。在循環(huán)系統(tǒng)中，miR-21 通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)、炎癥因子激活和內皮功能障礙參與高血壓的發(fā)病和靶器官的損傷[23]。而miR-21 在HIE 患兒疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用可能包括以下幾個方面：①miR-21 通過直接作用于PDCD4 分子調節(jié)免疫功能，降低IL-6 水平，升高IL-10 水平[24-25]，并可以調節(jié)Smad7 分子通過Th17 細胞調節(jié)免疫功能[26-27]；②miR-21 通過PTEN-Akt 信號通路作用于Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax 等分子，抑制神經元細胞凋亡；③miR-21 通過PDCD4 分子和PTEN-Akt 信號通路抑制星形膠質細胞的增生，表性變化和病理性肥大。

綜上所述，本研究通過觀察新生兒HIE 患兒血清miR-21 表達水平和NBNA 評分，發(fā)現miR-21 表達水平在HIE發(fā)病早期上升，并且在恢復期miR-21水平與NBNA 評分呈負相關。miR-21 對HIE 具有早期診斷意義，miR-21 對HIE 的病情進展具有早期預測效果，為HIE 的早期診斷和病情進展提供新的依據和生物學標志物。