葉 偉 何金川 謝文霞程芳芳 楊夢瑤 馬 瑤

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 溫州 325000

中風(fēng)具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點[1]。腦缺血再灌注損傷（CIRI）的細胞凋亡是導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡的主要途徑之一[2]。細胞凋亡過程中Bcl-2和Bax基因起著重要的調(diào)控作用，它們之間的平衡決定了凋亡誘導(dǎo)[3]，Bcl-2為STAT3的下游靶因子，STAT3通過調(diào)節(jié)下游靶蛋白的表達從而在抗凋亡方面發(fā)揮作用。筆者在先前的研究中發(fā)現(xiàn)電針“百會”“內(nèi)關(guān)”可以迅速激活腦內(nèi)JAK2/STAT3信號通路，減少腦梗死體積，改善CIRI后小鼠的神經(jīng)功能[4]。隨后亦對Bcl-2及Bax表達影響作了進一步研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組：SPF級C57BL/6N小鼠60只，體質(zhì)量18～20g，年齡6～8周。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度23～25℃，濕度60%～80%，人工光照12h：12h明暗交替。予以自由飲食與飲水。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將所有小鼠分成3組：假手術(shù)組、對照組、電針組，每組20只。各組再分2h、8h、24h、7d四個亞組，每亞組各5只。

1.2 主要試劑和儀器：麻醉劑水合氯醛；2，3，5－三苯基氯化四氮唑、4%多聚甲醛溶液購自Solarbio公司；Bcl-2、Bax、P-JAK2、P-STAT3、β-actin-抗和堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔均購自美國CST公司。電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-rad；37℃恒溫箱；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；華佗牌SDZ-ⅡB電針儀電子針療儀；佳辰牌針灸針具（江蘇省吳江市佳辰針灸器械有限公司）。

1.3 小鼠MCAO模型制作：術(shù)前動物禁食24h，自由飲水。采用改良的Longa法制備MCAO小鼠模型，在1.5h后，拔出線栓，使動脈血流再灌注。整個實驗過程中注意小鼠保暖。小鼠蘇醒后，采用Longa的5分制法進行評定，1～3分為動物缺血模型建立成功的標(biāo)志。沒有神經(jīng)病理癥狀或者神經(jīng)病理癥狀不明顯的予以去除，用同一批次組別的小鼠制成合格模型后湊足數(shù)目。

1.4 干預(yù)方法：假手術(shù)組：小鼠接受相同的麻醉操作與模型組一樣的各項手術(shù)操作，但只進行動脈分離的操作，不插入線栓，不給予電針干預(yù)。模型組：采用改良Longa線栓法制備，缺血1.5h后拔出線栓，模型建立后不進行任何干預(yù)處理，不給予電針干預(yù)。電針組：建立模型，缺血1.5h后拔出線栓再灌注。造模成功后將小鼠固定在筒形小鼠固定器上，暴露小鼠前肢、頭部，參照郭義主編《實驗針灸學(xué)》的擇穴方法取“百會”“內(nèi)關(guān)”（患側(cè)）。使用0.16mm×13mm毫針，“百會”穴沿皮平刺2mm，“內(nèi)關(guān)”穴直刺0.3mm。選用SDZ-ⅡB型華佗牌電針儀進行電刺激，疏密波，頻率2/15hz，強度1mA，以小鼠安靜且穴周組織輕微抖動為度。第一次電針在小鼠造模后1小時立即開始，以后每天1次，每次30min，直到處死小鼠的那一天。

1.5 檢測指標(biāo)及方法：Bcl-2、Bax蛋白表達含量測定（Western Blot）：于再灌注后2h、8h、24h、7d各相應(yīng)時間點，分別取5只小鼠麻醉后，迅速處死，電針組和模型組取缺血側(cè)半暗帶，假手術(shù)組取同側(cè)皮質(zhì)。各組取適量組織加入組織裂解液混合物，冰上采用超聲波（80W）粉碎組織，隨后離心取上清液，用BCA法測量蛋白含量，樣品變性后行10%SDS-PAGE凝膠電泳，操作完畢后馬上進行轉(zhuǎn)膜，然后用3%BSA封閉1小時，封閉后切下P-JAK2蛋白、P-STAT3蛋白、BCL-2蛋白、BAX蛋白、β-actin對應(yīng)條帶，對應(yīng)一抗孵育過夜，TBST清洗加室溫二抗孵育，TBST清洗。將膜用ECL發(fā)光顯色液曝光，拍照保存。用Image J測量各條帶灰度值，并將目標(biāo)蛋白灰值和內(nèi)參灰度值的比值作為其相對表達量，進行各組的對比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 25.0軟件包對數(shù)據(jù)進行處理、分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，二分類資料采用最小顯著差值法（LSD）比較，多分類資料采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組MCAO小鼠缺血灶半暗帶區(qū)Bcl-2/Bax比值比較如圖1所示。假手術(shù)組的Bcl-2/Bax比值，7天內(nèi)表達平穩(wěn)，組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.O5）；與其他兩組對比，在各個時間點相比偏低（P＜0.O1）。模型組、電針組的變化趨勢相同：在I/R后2h開始升高，I/R后8h達高峰（P＜0.O1），隨后下降；在I/R后7d比值最低（P＜0.O1）；電針組與模型組組間比較，I/R后8h、24h Bcl-2/Bax比值電針組均高于模型組（P＜0.O1、P＜0.O5）；I/R后7d低于模型組（P＜0.O5）。

圖1 各組MCAO小鼠缺血灶半暗帶Bcl-2/Bax比較圖

3 討論

電針治療缺血性中風(fēng)是臨床上行之有效的方法之一[5]，許多研究發(fā)現(xiàn)缺血前給予單次或多次的電針治療，可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，降低缺血后再灌注損傷的程度，改善各種功能障礙，起到預(yù)防及治療腦神經(jīng)損傷的作用。百會穴是手足陽經(jīng)、督脈等多經(jīng)交會的部位，全身經(jīng)脈之氣匯聚之所，為古今醫(yī)家治療腦病之要穴；內(nèi)關(guān)為手厥陰心經(jīng)的絡(luò)穴，又是八脈交會穴之一，通于陰維脈，具有寧心定智、寬胸理氣、活血通絡(luò)止痛之功效，是針灸防治心腦疾病的首選穴。百會穴、內(nèi)關(guān)穴配合被廣泛用于治療中風(fēng)等臨床疾病。

有研究發(fā)現(xiàn)[6]腦缺血再灌注可誘發(fā)細胞凋亡，大鼠全腦I/R后，缺血2h再灌注0.5h，缺血區(qū)有較多的凋亡細胞；再灌注12h，凋亡細胞數(shù)量達高峰。因此我們選擇小鼠造模后1小時立即進行電針干預(yù)，并在前期實驗[4]中于I/R后不同時間點動態(tài)觀察I/R后梗死體積、PJAK2和P-STAT3表達變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)電針組的P-JAK2、P-STAT3水平于I/R后2h迅速升高，在I/R后8h、24h遠遠高于模型組與假手術(shù)組；同時，I/R后24h、7d各相應(yīng)時間點，電針組梗死體積明顯小于模型組與對照組，證實電針組的細胞凋亡程度低于模型組。

Bcl-2和Bax是一對功能上相對的凋亡調(diào)控基因，Bcl-2是抗凋亡基因，可阻止許多因素所誘導(dǎo)的細胞凋亡，而Bax是促凋亡基因，Bax蛋白不但拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且有直接促進細胞凋亡的功能；它們是JAK2/STAT3信號通路的下游靶因子，在抗凋亡、減輕炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮作用。本次實驗中，I/R后，電針組小鼠腦組織半暗帶區(qū)Bcl-2表達減弱，但Bax的表達更少，因此Bcl-2/Bax比值反而逐步上升，到24 h達到高峰，且每個時間段的比值高于模型組。推測電針雖然抑制了Bcl-2，但同時更強烈抑制Bax的表達，使Bcl-2/Bax比值上升達到抗凋亡作用；因此在I/R后24h、7d，電針組梗死體積明顯小于模型組，提示電針有提高Bcl-2/Bax比值達到減輕CIRI的作用。結(jié)合前期的實驗結(jié)果，推測電針可迅速加快JAK/STAT信號通路活化，促進半暗帶中P-JAK2和P-STAT3的表達，增加Bcl-2/Bax比值，參與細胞抗凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過程，這可能是針刺干預(yù)CIRI的部分作用機制。