曹慶營 李美艷 牛廣旭 韓新彥

(1.河北工程大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；2.邯鄲市中心醫(yī)院婦一科；3.邯鄲市中心醫(yī)院病理科, 河北 邯鄲 056008)

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，在我國宮頸癌發(fā)生率正以每年2%～3%的速度持續(xù)增長[1]。宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(squamous intraepithelial lesion, SIL)與子宮頸癌密切相關(guān)，六成以上低級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(low grade cervical squamous intraepithelial lesions, LSIL)可自行消退，但高級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade cervical squamous intraepithelial lesions, HSIL)具有癌變潛能，其中有約20%可進(jìn)展為浸潤癌，被視為癌前病變[2]。實(shí)踐和研究表明，HSIL需要宮頸錐形切除，LSIL只需隨訪即可。然而，并不是所有的LSIL均可達(dá)到安全隨診，如何區(qū)分LSIL中有進(jìn)展為HSIL風(fēng)險的病例，尚無可靠生物標(biāo)記物[3]。相關(guān)研究指出，細(xì)胞角蛋白7(cytokeratin 7, CK7)在多種腫瘤組織中高表達(dá)[4]，抑癌基因P16參與細(xì)胞增殖調(diào)控，與多種腫瘤的形成相關(guān)[5-6]，鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC-Ag)為子宮頸癌輔助診斷常用腫瘤標(biāo)志物[1]，三者均與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，本文旨在探討三者單獨(dú)及聯(lián)合檢測對SIL的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年8月～2019年12月邯鄲市中心醫(yī)院婦一科收治的264例患者為研究對象，根據(jù)TCT及HPV檢查結(jié)果分為對照組、LSIL組和HSIL組三組。其中炎癥患者77例作為對照組、LSIL患者92例、HSIL患者95例?；颊吣挲g范圍20～68歲，中位年齡38歲，平均年齡(36.93±5.58)歲。收集標(biāo)本要求：檢查前3天內(nèi)不做陰道沖洗，不使用陰道內(nèi)藥物，24小時內(nèi)禁止性行為，并在非經(jīng)期檢查。宮頸活檢：對TCT檢查為ASCUS及以上病變或高危HPV檢測為陽性的婦女均行陰道鏡檢查，宮頸上皮如果見到醋酸白色上皮、點(diǎn)狀血管、鑲嵌、異型血管及碘試驗(yàn)陰性區(qū)，在懷疑病變區(qū)域進(jìn)行活檢，所取組織行常規(guī)石蠟切片檢查。宮頸環(huán)形電刀切除術(shù)：患者取膀胱截石位，常規(guī)消毒、鋪巾，陰道鏡定位后，根據(jù)病變程度選擇電切環(huán)，由2名高年資病理醫(yī)生復(fù)習(xí)病理切片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果判定 ①采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清SCC-Ag水平。抽取入選者清晨空腹靜脈血大約3～5 mL，采用3500 r/min速率離心10 min，然后分離血清，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光分析儀(型號：MAGLUMl4000)進(jìn)行血清SCC-Ag水平檢測，試劑來自羅氏公司原裝配套試劑，所有檢測步驟均需嚴(yán)格參照試劑盒說明書(SCC-Ag陽性標(biāo)準(zhǔn)：>2.5 ng/mL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SCC-Ag陽性44例，陰性220例。②采用免疫組織化學(xué)SP法檢測CK7和P16蛋白的表達(dá)情況。標(biāo)本檢測：主要試劑為鼠抗人CK7單克隆抗體，PAS染色試劑盒購自美國Sigma公司，免疫組織化學(xué)SP試劑盒、PBS緩沖液、DAB試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司，CK7一抗購自廣州安必平公司，各實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按相應(yīng)試劑的說明書進(jìn)行操作。免疫組化SP法步驟和判定評分標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[7]，判定標(biāo)準(zhǔn)：胞漿和/或胞膜著色為CK7陽性；而斑塊著色和/或未著色被認(rèn)為是CK7陰性；鱗狀上皮基底和基底旁細(xì)胞層出現(xiàn)連續(xù)性棕黃色著色，伴或不伴有表層細(xì)胞著色，判定為P16陽性；點(diǎn)狀、灶狀著色或無著色判定為陰性。免疫組化染色結(jié)果提示，CK7陽性101例，陰性163例；P16陽性140例，陰性124例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計軟件IBM SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算處理，各計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用2檢驗(yàn)，用Pearson法和連續(xù)校正公式來計算。采用列聯(lián)系數(shù)進(jìn)行CK7、SCC-Ag、P16三者之間的相關(guān)性分析。SIL的診斷效能評價指標(biāo)采用靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)表示(%)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK7、SCC-Ag、P16及其聯(lián)合在各組內(nèi)膜組織中表達(dá)的比較 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法和免疫組化SP法，檢測血清SCC-Ag水平和CK7、P16蛋白表達(dá)，包含單項檢測、兩兩配對檢測及三者聯(lián)合檢測共7組，多項觀察指標(biāo)在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)情況。其中，HSIL組各指標(biāo)及其組合的陽性表達(dá)率均明顯高于LSIL及對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1、表1。

2.2 CK7、SCC-Ag和P16在各組中的相關(guān)關(guān)系 應(yīng)用列聯(lián)系數(shù)對CK7、SCC-Ag、P16蛋白三者在各組中表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CK7與SCC-Ag呈正相關(guān)(r=0.204，P<0.001)，CK7與P16表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.437，P<0.001)，SCC-Ag與P16表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.350，P<0.001)，三者均呈正相關(guān)關(guān)系，表明三者在SIL的發(fā)生、發(fā)展中具有明顯的正向協(xié)同效應(yīng)(r均為正數(shù)；P均<0.05)，見表2～4。

圖1 SP法檢測CK7、P16蛋白在LSIL及HSIL中的表達(dá)(200×)

表1 CK7、P16、SCC-Ag及其聯(lián)合在各組中陽性率比較(×10-2)

表2 CK7蛋白和SCC-Ag表達(dá)的關(guān)系

2.3 單獨(dú)或聯(lián)合檢測CK7、SCC-Ag和P16對SIL診斷效能分析 以宮頸活檢病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，SCC-Ag和CK7、P16蛋白兩兩聯(lián)合或三者聯(lián)合檢測中任一項為陽性即視為檢測結(jié)果陽性，兩兩配對檢測中兩者均為陰性或三者聯(lián)合檢測中三者均為陰性視為檢測結(jié)果陰性，診斷效能分析結(jié)果見表5。

表3 CK7和P16蛋白表達(dá)的關(guān)系

表4 P16蛋白和SCC-Ag表達(dá)的關(guān)系

表5 CK7、SCC-Ag、P16蛋白及其聯(lián)合檢測的診斷效能比較(×10-2)

3 討論

宮頸癌的發(fā)生是一個多因素多階段的長期過程[9]，隨著篩查覆蓋面的越來越廣，宮頸疾病的檢出率也越來越高，目前宮頸病變的診斷方法主要依靠病理診斷，而病理診斷過程中摻雜了很多主觀因素[10]。選擇可以早期診斷、準(zhǔn)確性高、結(jié)果客觀、可重復(fù)性高的宮頸癌診斷方法在臨床治療當(dāng)中具有十分重要的意義[11]，因此篩查出高風(fēng)險人群，找出HSIL患者并給予及時的干預(yù)才是宮頸癌防治的關(guān)鍵所在[12]。相關(guān)基因及蛋白在原位組織特異性的過表達(dá)，不僅為研究疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了新思路，也為病變的診斷及治療提供特性強(qiáng)的生物標(biāo)記與靶點(diǎn)[5]。

細(xì)胞角蛋白(CK)是一種細(xì)胞中間絲蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架蛋白，在細(xì)胞分化的不同階段及不同類型的上皮細(xì)胞表達(dá)不同[2,13]。CK7廣泛表達(dá)于多種腫瘤中，常陽性表達(dá)[14]，可作為宮頸鱗柱交界標(biāo)記物[13]，是宮頸疾病進(jìn)展的標(biāo)志物，在炎癥和腫瘤中均扮演著重要的角色[2]。CK7陽性的LSIL更易進(jìn)展為HSIL[3]。本研究中CK7蛋白染色結(jié)果顯示，CK7在對照組、LSIL組和HSIL組中的陽性表達(dá)率分別是10.39%、31.52%、67.37%，可見隨著宮頸病變級別的升高，其表達(dá)率逐漸升高。這與潘嬙微、賈帥[2-3]等研究結(jié)果一致。

SCC-Ag為子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中分離出的一種糖蛋白，存在于鱗狀細(xì)胞癌的胞漿內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原TA-4亞段[15]，其血清水平檢測常用于多種器官鱗狀細(xì)胞癌診斷[15-16]。本研究中檢測血清SCC-Ag結(jié)果顯示，對照組、LSIL組和HSIL組SCC-Ag水平陽性率分別為6.49%、15.22%、26.32%，HSIL組中血清SCC-Ag表達(dá)水平陽性的比率顯著增高，SIL組較其他組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=9.948，P=0.002)。這與王元元[1]等的研究結(jié)果一致。提示高SCC-Ag表達(dá)水平可能促進(jìn)SIL的發(fā)生發(fā)展，SCC-Ag的檢測可能成為臨床預(yù)測SIL的一個指標(biāo)。

P16 是細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDK) 的抑制蛋白[17]，HSIL中p16蛋白呈過表達(dá)[18]。臨床上P16蛋白表達(dá)是隨著炎癥病變程度的加重表達(dá)逐漸增強(qiáng)[19]。第4版WHO女性腫瘤分類中，P16推薦用于SIL分級診斷。P16被認(rèn)為是CIN進(jìn)展最具價值的指標(biāo)[18,20]。本實(shí)驗(yàn)中P16蛋白染色表達(dá)結(jié)果顯示，P16在對照組、LSIL組和HSIL組中，陽性表達(dá)率分別是5.19%、48.91%、95.79%，可見隨著宮頸病變級別的升高，其陽性表達(dá)程度逐漸增高。P16在HSIL組較其他組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=108.933，P<0.05)，提示P16的高表達(dá)和SIL的形成發(fā)展過程密切相關(guān)，這與董花[5]等的研究結(jié)果一致。

本研究分析統(tǒng)計CK7、SCC-Ag、P16三者的相關(guān)性結(jié)果顯示，CK7蛋白表達(dá)陽性的SIL中P16蛋白表達(dá)陽性率更高，CK7蛋白高表達(dá)的SIL，更容易轉(zhuǎn)化為宮頸癌前病變，預(yù)后更差。與SCC-Ag及P16蛋白一起與SIL病情進(jìn)展聯(lián)系緊密，提示三者可能參與了SIL細(xì)胞增殖調(diào)控，在SIL的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)展至更高級別SIL過程中起到重要作用。三者具有明顯的正向協(xié)同效應(yīng)，可共同作為SIL診斷的標(biāo)志物，為尋求SIL生物學(xué)檢測排查新方法提供理論依據(jù)。提示聯(lián)合觀察CK7、SCC-Ag和P16各項指標(biāo)能夠?yàn)镠SIL的鑒別提供較為準(zhǔn)確的指導(dǎo)，與魏杰[15]等報道一致。

多指標(biāo)聯(lián)合檢測是提高病理診斷準(zhǔn)確性的有效方法，本文研究了CK7、SCC-Ag和P16蛋白單項、兩兩配對及三項聯(lián)合檢測對SIL的診斷價值，結(jié)果顯示，各指標(biāo)進(jìn)行單項檢測時，P16的靈敏度、準(zhǔn)確度高于CK7和SCC-Ag，說明P16較其他腫瘤標(biāo)志物具有較強(qiáng)的優(yōu)勢。進(jìn)一步兩兩聯(lián)合分別檢測靈敏度、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)，較單項檢測均有明顯升高。CK7+SCC-Ag+P16三指標(biāo)聯(lián)合檢測時診斷效能達(dá)到被測7組中的最高：靈敏度98.95%，陰性預(yù)測值99.00%，約登指數(shù)57.53%，明顯高于各單項及兩兩配對SIL檢測的診斷效能，三者聯(lián)合檢測在SIL診斷中更有優(yōu)勢。這反映出對HSIL組的受試者而言，聯(lián)合檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性的檢出率相當(dāng)可信，對非HSIL組的受試者實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測為陰性的結(jié)果相當(dāng)可信。

4 結(jié)論

CK7、P16及SCC-Ag在LSIL進(jìn)展中是有意義的參考指標(biāo)，三者具有一致性、協(xié)同性，其聯(lián)合檢測可作為SIL診斷的價值指標(biāo)之一，能有效指導(dǎo)患者臨床診治。