郭慧靜，陳國剛，趙志永

（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

0 引言

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz） 是一種藥食同源的多年生草本植物，為菊科蒲公英屬，又名華花郎、婆婆丁等[1]。蒲公英是一味傳統(tǒng)的中草藥，其花、葉、根均可入藥，具有清熱解毒、消腫散瘀、排毒利尿等功效[2]。有研究結(jié)果表明，蒲公英全草中含有甾醇類、香豆素類、多酚類、黃酮類及糖類等多種功能成分[3-4]。其中，多糖作為蒲公英功能成分的重要組成之一具有重要的研究價(jià)值。已有報(bào)道指出，蒲公英多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性[5]和抗菌活性[6]，此外還可以顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)和吞噬指數(shù)等，并促進(jìn)免疫器官的生長發(fā)育，從而增強(qiáng)小鼠的免疫功能[7]。石丹等人[8]研究發(fā)現(xiàn)蒲公英多糖還可以改善林可霉素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)，表明其具有微生態(tài)調(diào)節(jié)的作用。以上研究集中在蒲公英多糖的藥理活性方面，對于其成分及結(jié)構(gòu)方面的報(bào)道還相對較少，高金波等人[9]采用柱前衍生化法測定蒲公英多糖中的單糖組成，表明主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成。Chen M 等人[10]經(jīng)陰離子柱和凝膠柱分離純化蒲公英多糖得到一個(gè)均一的水溶性多糖組分，該組分的分子量為80 kDa，單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖。

目前，對蒲公英多糖提取方法的研究較多，而有關(guān)醇沉分級純化蒲公英多糖及不同組分的成分、結(jié)構(gòu)和生物活性的報(bào)道還相對較少。為了進(jìn)一步探究蒲公英多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性，試驗(yàn)利用分級醇沉的方法對超聲輔助提取得到的蒲公英多糖進(jìn)行純化分級，得到相應(yīng)的多糖組分，測定不同組分的糖含量、蛋白質(zhì)含量及糖醛酸含量等理化指標(biāo)，并采用GC-MS 分析各組分的單糖組成，并比較各組分的體外降血糖和抗氧化活性，篩選出活性較高的組分，為蒲公英多糖的深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蒲公英全草，采自新疆哈密地區(qū)，經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院韓博教授鑒定為菊科蒲公英屬植物。將原料洗凈，置于50 ℃烘箱中干燥，備用。α - 葡萄糖苷酶、考馬斯亮藍(lán)G-250，上海源葉生物技術(shù)有限公司提供；PNPG，上海寶曼生物科技有限公司提供；牛血清蛋白，美國AMRESCO 公司提供；單糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma 公司提供；濃硫酸、苯酚、吡啶、咔唑、維C、無水乙醇、鄰苯三酚、1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三氟乙酸、醋酸酐等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，榮華儀器制造（江蘇） 有限公司產(chǎn)品；KQ-200VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Multifuge X1R 型高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；DGG-9053AD 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FDU-1200 型冷凍干燥機(jī)，上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2600 型紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司產(chǎn)品；Nicolet iS10 型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；QP2010 型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蒲公英多糖提取工藝流程

蒲公英原料→烘干→粉碎過篩→脫色、脫脂→超聲處理→熱水浸提→抽濾、濃縮→乙醇沉淀→蒲公英粗多糖→分級醇沉→冷凍干燥→蒲公英多糖不同醇沉組分。

1.3.2 蒲公英多糖的分級醇沉

將得到的蒲公英多糖配制成10%的多糖溶液，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，去除不溶性雜質(zhì)。在溶液中加入無水乙醇，使得其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%，于4 ℃冰箱中放置12 h，離心分離收集多糖獲得20%醇沉組分。在上清液中繼續(xù)加入無水乙醇，使得乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%，4 ℃下醇沉過夜，離心分離獲得40%多糖組分。按照上述方法，依次得到20%，40%，60%，80%的多糖醇沉組分。所得沉淀用蒸餾水透析72 h，透析液蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，得到不同多糖組分（依次為PD-20，PD-40，PD-60 和PD-80）。

1.3.3 不同組分化學(xué)組成分析

采用苯酚- 硫酸法[11]對不同組分總糖含量進(jìn)行測定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長490 nm 處測定糖含量，以葡萄糖質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.015 5X-0.009 8，R2=0.999 6。采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法[12]測定蛋白含量。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長595 nm 處測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.006 2X+0.010 9，R2=0.999 2。采用硫酸- 咔唑法[13]測定糖醛酸含量。以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長530 nm 處測定糖醛酸含量，以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=4.586 5X-0.029 6，R2=0.999 7。

1.3.4 不同組分單糖組成分析

稱取3 mg 待測多糖樣品溶解于2 mol/L 三氟乙酸中，在溫度120 ℃下水解2 h 后用甲醇反復(fù)蒸發(fā)除去三氟乙酸，殘基溶于蒸餾水中并在室溫下用硼氫化鈉還原3 h，加適量冰醋酸中和過量的硼氫化鈉。中和后蒸發(fā)至干，殘?jiān)靡宜狒?00 ℃下乙?；? h，冷卻后加入甲苯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余的醋酐。乙?；a(chǎn)物用3 mL 氯仿溶解，加入少量蒸餾水充分混合后除去上層水溶液，最后用無水硫酸鈉除去氯仿層的水分，定容至10 mL 后進(jìn)行GC-MS 檢測。

GC-MS條件如下：RXI-5 SIL MS色譜柱（30 m×0.25 mm×25 μm）；升溫程序：起始溫度為120 ℃，以3 ℃/min 升到250 ℃，保持5min；進(jìn)樣口和檢測器溫度為250 ℃，載氣為氦氣，流速為1 mL/min。

1.3.5 光譜分析

參照Wang L 等人[14]方法，用蒸餾水配制2 mg/mL的多糖溶液，于波長200～400 nm 處進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)掃描圖判斷是否存在核酸及蛋白質(zhì)。參照Chen G等人[15]方法，稱取多糖待測組分各2 mg，加入100 mg烘干至恒質(zhì)量的KBr，置研缽中研磨均勻，用電動(dòng)壓片機(jī)壓片，在4 000～400 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.6 抑制α - 葡萄糖苷酶活性測定

根據(jù)文獻(xiàn)[16]方法并稍加修改，取濃度為0.2 U/mL α - 葡萄糖苷酶溶液0.1 mL 加入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液2 mL（pH 值6.8），于37 ℃下水浴15 min，加入樣品溶液反應(yīng)10 min 后再加入25 mmol/L PNPG 0.25 mL。水浴30 min 后，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液2 mL 終止反應(yīng)，于波長400 nm 處測定吸光度（A2）；以1 mL 緩沖液替代樣品溶液，測其吸光度值為（A0）；以0.1 mL 緩沖液替代酶液測其吸光值為（A1）。重復(fù)測定3 次，并以阿卡波糖為陽性對照。

此外，酶活力定義為溫度37 ℃，pH 值6.8 條件下，1 min 內(nèi)水解底物（PNPG） 產(chǎn)生1 μmol 對硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.7 抗氧化活性測定

（1） 清除DPPH 自由基活性測定。參照Liu Y 等人[17]方法，稍加修改。依次移取質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL 的多糖溶液2 mL，分別加入0.1 mmoL DPPH - 乙醇溶液2 mL，混合均勻后常溫暗處反應(yīng)30 min。維C 溶液作陽性對照，于波長517 nm 處測定吸光值，并以下式計(jì)算清除能力：

式中：A2——DPPH 溶液和樣品混合物的吸光度；

A1——沒有添加DPPH 溶液樣品的吸光度；

A0——沒有添加樣品的DPPH 溶液的吸光度。

（2） 清除超氧陰離子活性測定。參照Bo J 等人[18]方法，略作修改。將50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液4.5 mL（pH 值8.2） 和0.2 mL 不同質(zhì)量濃度的多糖溶液在25 ℃下水浴20 min。加入25 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.2 mL，靜置反應(yīng)5 min 后立即加入0.1 mL HCl 溶液（10 mol/L） 終止反應(yīng)，并于波長320 nm處測定吸光度。以維C 作為陽性對照，并利用以下公式計(jì)算清除能力：

式中：A2——鄰苯三酚和樣品混合物的吸光度；

A1——未加鄰苯三酚的樣品吸光度；

A0——未加樣品的鄰苯三酚的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用3 次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，采用Excel 2010，SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級醇沉樣品化學(xué)組成分析

分級醇沉制備的蒲公英多糖樣品為淡黃色粉末，可溶于水，不溶于無水乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑。

不同組分蒲公英多糖的化學(xué)組成見表1。

其中，PD-40 和PD-80 的總糖含量較高，且PD-80 最高，總糖含量達(dá)到64.41%，而PD-20 含量最低，為32.73%。4 個(gè)組分的糖醛酸含量沒有顯著差異，范圍為25%～30%。4 個(gè)組分的蛋白質(zhì)含量都較高，為17%～27%，差異不顯著，推測4 種組分多糖均為蛋白結(jié)合的復(fù)合物。由表1 可知，4 個(gè)組分中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)三者含量之和均達(dá)到90%，純度較高，可以用來進(jìn)一步分析。

表1 不同組分蒲公英多糖的化學(xué)組成/%

2.2 分級醇沉樣品單糖組成分析

7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜結(jié)果見圖1。

圖1 7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜結(jié)果

由圖1 可知，這7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生物分離程度較好。通過GC-MS 檢測，分級醇沉所得的各組分蒲公英多糖的單糖組成分析結(jié)果。

不同組分蒲公英多糖的單糖組成物質(zhì)的量比見表2。

表2 不同組分蒲公英多糖的單糖組成物質(zhì)的量比/%

由表2 可知，4 種組分樣品所含有的單糖種類相同，均含有除了巖藻糖和木糖之外的其他5 種單糖，但單糖組成比例存在顯著差異。其中，各組分中葡萄糖含量最高，其次是阿拉伯糖，鼠李糖含量最低。

2.3 紫外光譜分析

不同組分多糖紫外掃描圖譜見圖2。

蒲公英多糖分級醇沉得到4 個(gè)組分在波長200～400 nm 經(jīng)紫外掃描后的結(jié)果。

圖2 不同組分多糖紫外掃描圖譜

由圖2 可知，這4 種樣品于波長260 nm 處均沒有吸收峰，表明4 種多糖均不含核酸，于波長280 nm處均有吸收峰，其中PD-20 吸收峰最明顯，這表明4 個(gè)組分中都含有蛋白質(zhì)，且PD-20 蛋白質(zhì)含量最高，這與2.1 化學(xué)組成分析中蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果基本一致。

2.4 紅外光譜分析

不同組分多糖紅外掃描圖譜見圖3。

圖3 不同組分多糖紅外掃描圖譜

由圖3可知，4 個(gè)組分的紅外光譜掃描圖十分相似，這表明4 個(gè)組分中的化合物組成及其分子結(jié)構(gòu)基本相同，這與組分的理化性質(zhì)及單糖組成測定結(jié)果基本一致。以PD-20 為例，其中3 423 cm-1左右寬而強(qiáng)的吸收峰是由O-H 伸縮振動(dòng)引起的；2 924 cm-1左右的吸收峰是甲基或亞甲基C-H 伸縮振動(dòng)引起的，而1 400～1 200 cm-1的一組吸收峰是C-H 變角振動(dòng)形成的，以上3 個(gè)吸收峰為多糖的特征吸收峰[17]，由此可以初步判定PD-20～80 這4 個(gè)組分均為多糖。在1 636 cm-1左右的吸收峰由C=O 伸縮振動(dòng)形成的，表明糖醛酸的存在；1 035 cm-1和1 077 cm-1左右的吸收峰是由C-N 伸縮振動(dòng)形成的，由此可以推斷這4 個(gè)組分中均含有蛋白質(zhì)，這與化學(xué)組成分析和紫外掃描結(jié)果一致。圖中1 432 cm-1處的吸收峰是表明存在糖醛酸；890～1 200 cm-1的吸收峰是β - 吡喃型糖苷的特征吸收峰。

2.5 蒲公英多糖體外降血糖活性研究

不同組分多糖對α- 葡萄糖苷酶的抑制率見圖4。

圖4 不同組分多糖對α - 葡萄糖苷酶的抑制率

由圖4 可知，4 個(gè)組分多糖樣品在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均具有一定的α - 葡萄糖苷酶抑制能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制能力逐漸增強(qiáng)。此外，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，IC50值逐漸減小，表明抑制α -葡萄糖苷酶的能力逐漸增大，即PD-80＞PD-60＞PD-40＞PD-20。PD-80 的抑制能力最強(qiáng)，IC50為0.56 mg/mL（表3），多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，抑制率達(dá)到70.05%。可能是由于經(jīng)過分級醇沉，小分子物質(zhì)、色素等雜質(zhì)被脫除，對其功能基團(tuán)影響變小，導(dǎo)致抑制α - 葡萄糖苷酶能力增強(qiáng)[19-20]。

不同組分多糖對自由基和糖苷酶的半抑制質(zhì)量濃度（IC50） 見表3。

表3 不同組分多糖對自由基和糖苷酶的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）

2.6 蒲公英多糖抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH 自由基清除能力

不同多糖組分對自由基的清除能力見圖5。

由圖5（a） 可知，4 個(gè)蒲公英多糖組分對DPPH的清除能力均隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)；IC50值越小，表明其抗氧化活性越好。其中，PD-80 的清除活性表現(xiàn)良好，IC50為0.26 mg/mL，清除DPPH 能力優(yōu)于其他3 個(gè)組分，多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)清除率達(dá)到84.32%。其次為PD-60，IC50為0.29 mg/mL，與PD-80 無顯著差異。PD-20 和PD-40 清除DPPH活性相對較弱，PD-20 組分IC50為0.42 mg/mL，清除DPPH 能力顯著高于PD-40 組分0.54 mg/mL（p＜0.05）。

2.6.2 超氧陰離子清除能力

圖5 不同多糖組分對自由基的清除能力

由圖5（b） 可知，4 個(gè)多糖組分對超氧陰離子清除活性均隨多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，PD-80 與PD-60 的半抑制質(zhì)量濃度（IC50） 分別為0.25，0.30 mg/mL，抗氧化活性顯著高于其他2 種多糖（p＜0.05）。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL 時(shí)，PD-80 對超氧陰離子的清除率達(dá)到86.47%左右；當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度超過0.3 mg/mL 時(shí)，PD-20 對超氧陰離子的清除率漸漸高于PD-40；但都顯著低于維C（p＜0.05）。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用超聲輔助提取和分級醇沉法獲得蒲公英粗多糖。設(shè)置20%，40%，60%和80%共4 個(gè)梯度，乙醇分級沉淀得到4 種蒲公英粗多糖，PD-80總糖含量最高，達(dá)到64.41%。各樣品均含有一定量的蛋白質(zhì)，PD-20 蛋白質(zhì)含量最高，其余3 組樣品蛋白質(zhì)含量PD-60＞PD-80＞PD-40，可能為結(jié)合態(tài)的蛋白質(zhì)。

研究不同組分的光譜學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)組分結(jié)構(gòu)無明顯變化，多糖結(jié)構(gòu)未受到破壞。4 個(gè)組分均含有阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5 種單糖，且葡萄糖含量最高，但單糖組成比例存在差異。4 個(gè)組分體外降血糖和抗氧化活性隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，呈量- 效關(guān)系。此外，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，抑制α - 葡萄糖苷酶和清除自由基的能力也逐漸增強(qiáng)。表明該方法可以快捷高效地得到不同組分蒲公英多糖，篩選出活性較高的組分，為蒲公英多糖的深入研究和開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。