李鳴,詹鵬 ,陳介南 ,王亞楠，周永財

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004；3.湖南省木本生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004；4.湖南省木質(zhì)資源定向轉(zhuǎn)化國際聯(lián)合實驗室，湖南 長沙 410004)

生物質(zhì)能源是解決能源危機(jī)的一條有效途徑，其中，預(yù)處理是制取生物質(zhì)能源的重要環(huán)節(jié)。以楊木等木質(zhì)纖維為原料，采用稀磷酸浸漬加蒸汽爆破是一種綠色高效的預(yù)處理技術(shù)，但同時也會生成副產(chǎn)物，如糠醛、5-羥甲基糠醛、對苯二酚、間苯二酚等生物抑制劑，對后續(xù)酶解及發(fā)酵過程產(chǎn)生抑制作用[1]。其中，糠醛和5-HMF分別由戊糖和己糖脫水形成，兩者具有相似的抑制作用(抑制菌體生長，增長延滯期)，但糠醛的毒性大于5-HMF[2]。酚類化合物主要由木質(zhì)素在高溫酸解等預(yù)處理過程中分解產(chǎn)生，其毒性較大，可造成細(xì)胞膜部分或整體的破壞[3]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

楊木片;磷酸、糠醛、5-羥甲基糠醛、對苯二酚、間苯二酚、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣均為分析純；微晶纖維素、羧甲基纖維素均為工業(yè)純；纖維素酶，滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。

QBS-80B型蒸汽爆破機(jī)； QBS-80 型蒸汽爆破機(jī)；GCMS-20100 Ultra型氣質(zhì)聯(lián)用儀;安捷倫1260 型高效液相色譜儀；安捷倫7890B 型氣相色譜儀；UV-2450 型紫外分光光度計； Z h WY-211C 型恒溫?fù)u床。

1.2 稀磷酸聯(lián)合蒸汽爆破預(yù)處理

楊木片，粉碎得楊木屑(0.2～0.8 cm),烘干。200 g楊木屑分別與純水和2%稀磷酸按固液比1∶2.5(質(zhì)量比)混勻，浸漬1 h ，裝入蒸汽爆破汽缸爆破，收集爆破渣，測合水率后恒溫(60 ℃)保存待分析。

1.3 纖維素酶解

平行稱取3 g微晶纖維素置于50 mL搖瓶中，加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH為4.8)浸泡一段時間，以稀檸檬酸溶液和稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解體系pH為5，將搖瓶置于高溫滅菌鍋滅菌0.5 h，殺滅微生物，避免其對酶解造成不利影響，冷卻至室溫。加入35 U/mL的纖維素酶液，酶解體系固液比為1∶10，搖瓶封口后置于50 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)，在120 r/min轉(zhuǎn)速下酶解48 h。離心，取上層清液測酶解液中的還原糖濃度，并以酶解液中還原糖濃度評價酶解效果。

1.4 乙醇發(fā)酵

3%的葡萄糖水溶液置于50 mL搖瓶中，加入0.05 mol/L的乙酸/乙酸鈉溶液，調(diào)節(jié)發(fā)酵體系pH=5。加入無機(jī)鹽(蛋白胨5.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L， 硫酸鎂1.0 g/L，氯化鈣0.25 g/L),將搖瓶置于高溫滅菌鍋滅菌0.5 h，殺滅微生物，避免其對發(fā)酵造成不利影響，冷卻至室溫。加入釀酒酵母2%，搖瓶封口后置于37 ℃的恒溫?fù)u床內(nèi)，在150 r/min 轉(zhuǎn)速下發(fā)酵一定時間,取樣檢測發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇的含量。

1.5 分析方法

預(yù)處理爆破液中主要降解產(chǎn)物包括糠醛、5-羥甲基糠醛、對苯二酚、間苯二酚，另外還有少量的葡萄糖。采用GC/MS 分析爆破液成分[4]，DNS法測爆破液還原糖[5]，高效液相色譜測糠醛、5-羥甲基糠醛[6]、對苯二酚、間苯二酚[7]，高效液相色譜測纖維素酶解后還原糖[8]。氣相色譜法測定乙醇含量[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理

采用GC/MS 檢測爆破液中的成分，結(jié)果見圖1和表1。

圖1 GC/MS檢測總離子流圖像

表1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)

由圖1和表1可知，鑒定出強(qiáng)度較高的 8 種化合物，爆破液中主要含有酚類、苯類、烷類及酸類物質(zhì)，相較于純水蒸氣爆破，采用稀磷酸浸漬加蒸汽爆破的預(yù)處理方式明顯提高了還原糖和各類抑制劑的含量。這些抑制劑會在生物乙醇的制備過程中通過抑制纖維素酶的酶活和微生物細(xì)胞的活性，降低生物乙醇的轉(zhuǎn)化率[10]。

2.2 纖維素酶解優(yōu)化

2.2.1 單因素酶解優(yōu)化 微晶纖維素單因素酶解實驗結(jié)果見圖2。

圖2 單因素酶解優(yōu)化

由圖2可知，微晶纖維素的最優(yōu)酶解溫度為50 ℃， 溫度過高或者過低都會降低纖維素酶的活性，影響酶解效果[11]。最優(yōu)酶液載入量為35 U/mL， 原因可能是酶對底物具有競爭性的抑制作用，一定量纖維素內(nèi)可以與酶分子相結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)有限，如果結(jié)合點(diǎn)已經(jīng)被纖維素酶占據(jù)，繼續(xù)提高酶用量，也不能達(dá)到更高的酶解效果。最佳酶解體系固液比為1∶10，最佳酶解 pH 為5，最佳酶解時間為48 h。

2.2.2 正交實驗優(yōu)化 依據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取酶解溫度、酶液載入量、酶解體系固液比、酶解體系 pH值4個因素作為研究對象，酶解時間選取為48 h， 設(shè)計正交實驗，對酶解的工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，因素與水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 酶解實驗設(shè)計

表3 微晶纖維素酶解正交實驗結(jié)果

由表3可知，影響微晶纖維素酶解的主次順序為酶解溫度>酶液載入量>體系固液比>酶解pH，最佳的酶解條件為A2B2C3D1，即酶解溫度50 ℃，酶液載入量30 U/mL，酶解體系固液比1∶11，酶解體系 pH=4.8。

2.3 抑制劑對纖維降解率的影響

由圖3可知，在最優(yōu)酶解條件下，加入稀磷酸浸泡加蒸汽爆破產(chǎn)生的抑制劑后，對纖維素降解產(chǎn)生最大影響的是間苯二酚，其次是對苯二酚、5-羥甲基糠醛、糠醛，原因可能是酸浸加蒸汽爆破產(chǎn)生的單一酚類抑制劑遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單一醛類抑制劑含量，因此，楊木預(yù)處理產(chǎn)生的抑制劑中酚類抑制劑對酶解產(chǎn)生的影響要高于醛類抑制劑。

圖3 抑制劑對纖維素酶解的影響

在預(yù)處理過程中，不會僅僅只是產(chǎn)生單一的抑制劑，因此需要探究多種抑制劑對纖維素降解的影響。由圖3可知，在添加單一酚類抑制劑和單一醛類抑制劑后，纖維素降解率有明顯降低，且酚類抑制劑對降解率的影響較大，而將兩種酚類抑制劑和兩種醛類抑制劑復(fù)合后，纖維素降解率下降并不明顯，且4種抑制劑復(fù)合作用比單一抑制劑或單一種類抑制劑對纖維素降解影響更大，在4種抑制劑復(fù)合后，對纖維素酶解的抑制作用并不是各發(fā)酵抑制劑抑制結(jié)果的簡單疊加，它們之間可能還存在一定的協(xié)同作用[12]。

2.4 乙醇發(fā)酵優(yōu)化

2.4.1 單因素發(fā)酵優(yōu)化 單因素發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果見圖4。由圖4可知，由于在發(fā)酵過程中要考慮成本問題，在提高發(fā)酵率的同時要盡量減少菌液載入量，因此，最佳菌液載入量定為2%；最佳發(fā)酵溫度為37 ℃， 發(fā)酵的最佳pH是5，原因可能是過高或過低的溫度和pH抑制了菌種的活性，使得發(fā)酵不能達(dá)到很好的效果。

圖4 單因素發(fā)酵優(yōu)化

2.4.2 正交實驗優(yōu)化 據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計正交實驗，對葡萄糖發(fā)酵的工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，因素水平見表4，結(jié)果見表5。

表4 發(fā)酵實驗設(shè)計

表5 乙醇發(fā)酵正交實驗結(jié)果

由表5可知，影響葡萄糖發(fā)酵的主次順序為發(fā)酵溫度>菌液載入量>發(fā)酵 pH，最佳的酶解條件為A2B2C2，即發(fā)酵溫度37 ℃,菌液載入量為發(fā)酵液的2%,發(fā)酵 pH=5。

2.5 葡萄糖發(fā)酵實驗

2.5.1 預(yù)處理抑制劑對葡萄糖發(fā)酵的影響 由圖5可知，在單一種類的發(fā)酵抑制劑存在下，發(fā)酵液中發(fā)酵抑制劑對釀酒酵母乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用最大的是間苯二酚，其次是對苯二酚、糠醛、5-羥甲基糠醛；原因可能是預(yù)處理過程中產(chǎn)生的酚類抑制劑高于醛類抑制劑，因此，酚類抑制劑的抑制作用要高于醛類；糠醛的含量要低于5-羥甲基糠醛，但抑制作用卻強(qiáng)于后者，說明糠醛對酵母的毒性要高于5-羥甲基糠醛。

在添加單一酚類抑制劑和單一醛類抑制劑后，葡萄糖轉(zhuǎn)化率有明顯降低，且酚類抑制劑對轉(zhuǎn)化率的影響作用較大，對菌種的抑制作用也就更強(qiáng)；而將兩種酚類抑制劑和兩種醛類抑制劑復(fù)合后，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率有明顯下降，由此可知，抑制劑復(fù)合后對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率有明顯的協(xié)同作用[13-14]。

圖5 預(yù)處理抑制劑對發(fā)酵的影響

2.5.2 抑制劑濃度對葡萄糖發(fā)酵的影響 由圖6可知，隨著醛類抑制劑濃度的增高，葡萄糖轉(zhuǎn)化率均有明顯下降，糠醛的抑制作用要強(qiáng)于 5-HMF，當(dāng)抑制劑濃度達(dá)到0.88 mL/L時，抑制作用達(dá)到平衡，隨后，5-HMF的抑制作用強(qiáng)于糠醛；對于酚類抑制劑，隨著抑制劑濃度的增高，間苯二酚的抑制作用一直強(qiáng)于對苯二酚。由于預(yù)處理過程中生成的酚類抑制劑濃度遠(yuǎn)高于醛類抑制劑，而對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響差別卻不大，因此，同等含量情況下，醛類抑制劑的抑制作用要高于酚類。

圖6 抑制劑濃度對發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

(1)稀酸浸漬加蒸汽爆破預(yù)處理的楊木葡萄糖含量與抑制劑含量都要高于純水浸漬加蒸汽爆破預(yù)處理方式。其中，稀酸浸漬加蒸汽爆破預(yù)處理還原糖質(zhì)量濃度最高可達(dá)到23.61 g/L ，比純水加蒸汽爆破預(yù)處理還原糖含量13.07 g/L 高出10.54 g/L ，稀磷酸浸漬加蒸汽爆破預(yù)處理后，爆破液中各抑制劑含量分別為糠醛0.031 g/L、5-羥甲基糠醛0.029 g/L、對苯二酚1.51 g/L、間苯二酚1.242 g/L； 都要高于純水加蒸汽爆破預(yù)處理爆破液中的抑制劑含量糠醛0.005 g/L、5-羥甲基糠醛0.007 g/L、對苯二酚0.233 g/L、間苯二酚0.151 g/L 。

(2)微晶纖維素的最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃,酶液載入量30 U/mL，酶解體系固液比1∶11，酶解體系 pH=4.8；在最優(yōu)酶解條件與單一種類的抑制劑存在下，對苯二酚、間苯二酚、5-羥甲基糠醛、糠醛對纖維素降解率的影響逐漸降低。多種抑制劑的復(fù)配對纖維素降解的影響高于單一種類抑制劑對纖維素降解的影響。

(3)葡萄糖發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃，最佳菌液載入量為2%，最佳發(fā)酵pH是5，在無抑制劑的情況下，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到97.03%，在單一種類的發(fā)酵抑制劑存在下，發(fā)酵液中葡萄糖轉(zhuǎn)化率分別是96.23%(糠醛)、96.54%(5-羥甲基糠醛)、95.72%(對苯二酚)和95.68%(間苯二酚)；多種發(fā)酵抑制劑的復(fù)配對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響高于單一種類對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響。