劉小希， 鄒 文， 孟劉坤， 宋 民

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是 急 性 冠 狀 動 脈 綜 合 征（acute coronary syndrome，ACS）的主要治療方法之一，可有效改善動脈粥樣硬化斑塊堵塞血管引發(fā)的心肌缺血、缺氧［1-3］。近年來PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR）備受關(guān)注。文獻報道顯示普通金屬支架ISR發(fā)生率為15%～30%，即使是藥物洗脫支架，ISR發(fā)生率也高達10%［4］。尋找預(yù)示ISR的相關(guān)指標(biāo)，對患者預(yù)后改善有重要意義。然而目前臨床中缺乏靈敏度和特異度均較高的指標(biāo)預(yù)示ISR。受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）1是一種細(xì)胞膜上死亡受體家族觸發(fā)的細(xì)胞應(yīng)答上游調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡、炎性反應(yīng)和細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用［5］。有研究顯示RIPK1與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換關(guān)系密切，可通過核因子（NF）-κB途徑參與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，進而促進ISR［6］。血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)收縮表型轉(zhuǎn)換成合成表型過程可促進其增殖、遷移和分泌等增強，促進ISR發(fā)生和發(fā)展［7］。本研究檢測PIPK1表達水平，探究其與PCI術(shù)后ISR的關(guān)系，以期為預(yù)防和治療ISR提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年4月至2019年6月在北京阜外醫(yī)院接受PCI治療的188例ACS患者作為研究對象，根據(jù)《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》［8］診斷ACS。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次診斷為ACS；②配合完成相關(guān)檢查；③PCI術(shù)后1年內(nèi)主訴疑似心絞痛不適癥狀，接受冠狀動脈造影檢查；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有ACS病史；②接受PCI外其他治療；③伴有慢性阻塞性肺疾病、高同型半胱氨酸血癥、下肢動脈硬化閉塞癥、惡性腫瘤等；④有心肌病、心瓣膜病史；⑤PCI術(shù)后不規(guī)律服用抗血小板聚集、調(diào)節(jié)糖脂代謝等藥物；⑥臨床資料不完整。188例ACS患者中男141例，女47例，年齡45～77（63.12±6.44）歲；ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）134例，非ST段抬高型心肌梗死（non-ST elevation myocardial infarction，NSTEMI）45例，不穩(wěn)定心絞痛（unstable angina，UA）9例。根據(jù)PCI術(shù)后1年是否發(fā)生ISR將患者分為ISR組（n=51）和非ISR組（n=137）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 信息收集

收集ACS患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙史、ACS類型、糖尿病史、高血壓史、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、總膽固 醇（total cholesterol，TC）、三 酰 甘 油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、血管病變位置、血管病變長度、血管病變支數(shù)及支架直徑等信息。

1.3 RIPK1表達水平檢測

抽取ACS患者PCI術(shù)前、術(shù)后7 d空腹外周靜脈血10 mL，F(xiàn)icoll密度梯度離心法［9］獲取外周血中單個核細(xì)胞。蛋白質(zhì)免疫印跡法［10］檢測單個核細(xì)胞中RIPK1表達水平。放射免疫沉淀法（RIPA）裂解單個核細(xì)胞，分離出總蛋白，二辛可酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒定量。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳（80～120 V）至溴酚藍跑出膠面，轉(zhuǎn)膜（300 mA），5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別滴加兔抗人RIPK1單克隆抗體、兔抗人β-肌動蛋白（actin）抗體（上海群己生物科技公司），4℃孵育過夜；滴加山羊抗兔二抗（上海群己生物科技公司），室溫下孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ELC）液顯影。Image J軟件計算RIPK1相對表達水平。

1.4 ISR檢查

所有ACS患者均于PCI術(shù)后1年復(fù)查冠狀動脈造影，觀察左前斜、右前斜及頭腳軸狀位投影，評估左主干、左前降支、左回旋支和右冠狀動脈狹窄程度。定量冠狀動脈造影（QCA）分析軟件（CASS，荷蘭Pie Medical Imaging公司）對造影圖像進行定量分析。ISR定義為支架內(nèi)和/或支架兩端5 mm內(nèi)管腔狹窄率≥50%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用R3.6.3軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較用配對樣本t檢驗。計數(shù)資料以例（n）表示，組間比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評價RIPK1診斷ACS患者ISR的效能。限制性立方樣條擬合logistic回歸法分析RIPK1與ACS患者ISR的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

兩組間患者年齡、性別、BMI、吸煙史、糖尿病史、高血壓史、SBP、DBP、TC、TG、HDL-C、ACS類型、血管病變位置和支架直徑差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ISR組FBG、LDL-C、3支血管病變占比和血管病變長度均高于非ISR組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組RIPK1表達水平比較

非ISR組、ISR組PCI術(shù)前RIPK1表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），術(shù)后RIPK1表達水平均降低，且非ISR組低于ISR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。非ISR組PCI術(shù)前、術(shù)后RIPK1降低程度（△RIPK1）高于ISR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1。

2.3 RIPK1評估ISR的價值

PCI術(shù)前、術(shù)后RIPK1診斷ISR的ROC曲線下面積、最佳截斷點、靈敏度、特異度分別為0.528（95%CI：0.454～0.601）、0.84、25.49%、85.40%，0.868（95%CI：0.812～0.913）、0.50、78.43%、84.67%；△RIPK1診斷ISR的ROC曲線下面積、最佳截斷點、靈敏度、特異度分別為0.736（95%CI：0.667～0.797）、0.28、78.43%、61.31%。PCI術(shù)后RIPK1診斷ISR的效能高于術(shù)前RIPK1和△RIPK1，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（Z=6.284、3.729，P＜0.001），見圖2。

2.4 影響ACS患者ISR的因素分析

將ACS患者PCI術(shù)后1年內(nèi)是否發(fā)生ISR作為因變量，F(xiàn)BG、LDL-C、血管病變支數(shù)、術(shù)后RIPK1和血管病變長度作為自變量，納入多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示FBG、血管病變支數(shù)、術(shù)后RIPK1和血管病變長度均為ACS患者PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR的獨立危險因素（P＜0.05），見表3。

表1 兩組基線資料比較

表2 兩組RIPK1表達水平比較 %

圖1 兩組RIPK1表達的蛋白質(zhì)免疫印跡圖

2.5 RIPK1與ISR的關(guān)系

用限制性立方樣條擬合logistic回歸法分析RIPK1與ISR的關(guān)系，節(jié)點個數(shù)為3時Akaike信息準(zhǔn)則（AIC）值最?。ˋIC=153.010），顯示RIPK1與ISR有關(guān)（χ2=37.14，P＜0.001），呈線性關(guān)系（非線性檢驗χ2=1.41，P=0.235）。將PCI術(shù)后RIPK1診斷ISR的最佳截斷點作為參考點，RIPK1＜0.50時，PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR發(fā)生風(fēng)險降低；RIPK1＞0.50時，PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR發(fā)生風(fēng)險增加，見圖3。

圖2 RIPK1診斷ISR的ROC曲線

表3 影響ACS患者ISR的因素分析

圖3 RIPK1與ISR限制性立方樣條圖

3 討論

外周血單個核細(xì)胞與ACS發(fā)病及進展關(guān)系密切，其可通過黏附、活化血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1β、C反應(yīng)蛋白等炎性介質(zhì)，促進ACS發(fā)病及進展［11］。本研究推測RIPK1通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換參與PCI術(shù)后ISR發(fā)生和發(fā)展過程，因此檢測外周血單個核細(xì)胞中RIPK1表達水平，探究其與ISR關(guān)系，有助于預(yù)防ISR，降低死亡率。本研究中ACS患者ISR發(fā)生率為27.1%，高于既往文獻報道的ISR發(fā)生率，推測原因可能在于受試者均于主訴疑似心絞痛不適癥狀后接受冠狀動脈血管造影檢查，ISR發(fā)生率偏高。本研究結(jié)果顯示PCI術(shù)后ISR組和非ISR組RIPK1表達水平均降低，而非ISR組低于ISR組，且非ISR組△RIPK1高于ISR組；提示RIPK1可能與ISR有關(guān)，其表達水平或可預(yù)測ISR發(fā)生情況。

本研究構(gòu)建RIPK1診斷PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR的ROC曲線，結(jié)果顯示PCI術(shù)后RIPK1診斷ISR的ROC曲線下面積、靈敏度、特異度分別為0.868、78.43%、84.67%，診斷效能高于術(shù)前RIPK1和△RIPK1；表明PCI術(shù)后RIPK1評價術(shù)后1年內(nèi)ISR的效能較高，但靈敏度偏低，尚可輔助評價ISR。

既往研究表明ISR危險因素較多。閻志等［12］研究顯示高血壓史、糖尿病史、LDL-C高于1.8 mmol/L、多支病變、支架位于左前降支、支架直徑＜3 mm，支架長度＞20 mm，均為冠心病患者PCI術(shù)后ISR的獨立危險因素。Cheng等［13］研究顯示糖尿病史和支架長度是PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR的獨立危險因素。Wu等［14］研究顯示2型糖尿病、支架長度和支架直徑與PCI術(shù)后ISR有關(guān)。此外，鐘繼明等［15］研究顯示伴糖尿病、伴高血壓、吸煙史、植入支架長度和支架直徑均為ISR的獨立相關(guān)因素。本研究采用多因素logistic回歸法分析影響ACS患者PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR的危險因素，結(jié)果顯示FBG、血管病變支數(shù)、PCI術(shù)后RIPK1和血管病變長度均為ACS患者PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR的獨立危險因素，而糖尿病史、高血壓史、吸煙史、支架直徑、病變位置和LDL-C等與PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR無關(guān)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果存在一定差異，可能與納入研究樣本量、地域等有關(guān)，后續(xù)需開展多中心大樣本研究驗證本研究結(jié)論。

包勤學(xué)等［6］研究顯示血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中RIPK1表達水平升高，血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換加快；抑制RIPK1表達可降低NF-κB的p65亞基磷酸化水平，同時血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移及分泌均受到一定程度抑制。本研究結(jié)果還顯示PCI術(shù)后RIPK1與ISR有關(guān)，且呈線性關(guān)系；RIPK1＜0.50時PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR發(fā)生風(fēng)險降低，RIPK1＞0.50時術(shù)后1年內(nèi)ISR發(fā)生風(fēng)險增加，推測原因在于外周血單個核細(xì)胞中RIPK1可通過促進NF-κB的p65亞基磷酸化誘導(dǎo)收縮表型的血管平滑肌細(xì)胞向合成表型的血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及分泌，加速ISR發(fā)病和進展。

綜上所述，RIPK1與ACS患者PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR有關(guān)，檢測其表達水平有助于預(yù)判PCI術(shù)后1年內(nèi)ISR發(fā)生情況。RIPK1高表達水平提示PCI術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生ISR風(fēng)險高。本研究為單中心研究，樣本量偏小，后續(xù)將開展多中心大樣本研究驗證本研究結(jié)論。