孫 娟， 王 寧， 陳宏坤， 宋權(quán)威， 楊曉晴， 趙朝成， 張秀霞， 鄭秀志

(1.中國(guó)石油大學(xué)(華東) 化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580；2.石油石化污染物控制與處理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.中國(guó)石油集團(tuán)安全環(huán)保技術(shù)研究院有限公司，北京 102206)

石油是一種重要的能源，在促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)也帶來(lái)了大量的環(huán)境問(wèn)題。在石油開(kāi)采、儲(chǔ)運(yùn)和生產(chǎn)加工等過(guò)程中，不可避免地會(huì)對(duì)土壤、地表水及地下水造成不同程度的污染。其中，在油田和油井鉆鑿過(guò)程中對(duì)周?chē)寥赖奈廴尽⑹烷_(kāi)采過(guò)程中形成的落地油、輸油管路的滲漏等，是土壤石油污染的主要途徑[1]。石油污染物可以影響土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)[2-10]。微生物與環(huán)境的相互作用是微生物在各種不同環(huán)境中生存和繁殖的關(guān)鍵。其中，土壤細(xì)菌群落是土壤微生物中數(shù)目最多、分布最廣且成分最豐富的微生物之一，土壤真菌是土壤微生物的主要成員，古菌是土壤中存在的一種特殊的生命形式。它們共同作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在碳循環(huán)、氮循環(huán)等生物地球化學(xué)進(jìn)程中起著不可替代的作用。同時(shí)，土壤的理化性質(zhì)和生物學(xué)特征也被土壤微生物通過(guò)不同途徑改變，包括有機(jī)質(zhì)的合成分解、污染物降解、養(yǎng)分固定與釋放等[11-17]。

目前，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究可采用變性梯度凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、熒光原位雜交、序列標(biāo)簽標(biāo)記的高通量測(cè)序以及宏基因組等技術(shù)。其中，高通量測(cè)序技術(shù)具有高準(zhǔn)確度、低成本等優(yōu)勢(shì)[18-19]。因此，筆者采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同污染程度的石油污染土壤樣品中細(xì)菌、真菌以及古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，探究微生物群落分布及其與石油污染土壤性質(zhì)之間的關(guān)系，為深入認(rèn)識(shí)油污土壤微生物群落分布特征以及油污土壤的高效生物修復(fù)技術(shù)的建立提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

實(shí)驗(yàn)試劑：牛肉浸膏、胰蛋白胨、瓊脂粉，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、四氯化碳、碳酸氫鈉、正己烷，AR，上海泰坦科技股份有限公司產(chǎn)品；硅酸鎂、氯化鉀、重鉻酸鉀、濃硫酸、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、鉬銻抗、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、濃鹽酸、高錳酸鉀、硅膠，AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；二氯甲烷、氫氧化鈉，AR，西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品。

油污土壤樣品：油污土壤采集地點(diǎn)位于東營(yíng)某煉油廠(東經(jīng)118°5′，北緯38°15′)的油罐區(qū)(YGQ)、污油場(chǎng)(WYC)、垃圾場(chǎng)(LJC)3個(gè)地點(diǎn)，各采集 0～20 cm 上層土壤樣品和20～50 cm下層土壤樣品，分別記為YGQ0-20、YGQ20-50、WYC0-20、WYC20-50、LJC0-20、LJC20-50。將各土壤樣品去除植物根系和石塊后經(jīng)2 mm尼龍篩過(guò)篩，備用。

1.2 土壤性質(zhì)測(cè)定方法

采集的新鮮土壤樣品立即采用烘干法進(jìn)行含水率的測(cè)定，并采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)量細(xì)菌總數(shù)。土壤樣品風(fēng)干后進(jìn)行其他性質(zhì)的測(cè)定。其中，采用篩分法測(cè)定土壤粒徑，采用酸度計(jì)法測(cè)定土壤pH值，采用電導(dǎo)率儀測(cè)定土壤電導(dǎo)率，采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)含量，采用凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮含量，采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法(TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì))測(cè)定土壤有效磷含量，采用四氯化碳萃取-紅外分光光度法(紅外光度測(cè)油儀2000-Ⅰ，吉林歐伊爾環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司產(chǎn)品)測(cè)定土壤油含量，采用比重瓶法測(cè)定土壤密度。對(duì)于測(cè)定的土壤性質(zhì)均進(jìn)行3次測(cè)定取平均值。

1.3 油污土壤烴類(lèi)組分分析方法

油污土壤樣品用二氯甲烷萃取后脫水、濃縮后過(guò)層析柱，飽和烴和芳香烴洗出液均濃縮到0.9 mL，分別加入100 μL正構(gòu)烷烴內(nèi)標(biāo)(C24D50，100 μg/mL)和100 μL多環(huán)芳烴內(nèi)標(biāo)(d14-三聯(lián)苯，20 μg/mL)，定容后采用安捷倫科技有限公司生產(chǎn)的7890A-5975C GC-ms聯(lián)用儀(配備MS5975型質(zhì)譜檢測(cè)器和30 m×0.25 mm×0.25 μm的HP-5ms毛細(xì)管色譜柱)測(cè)定萃取液中烴類(lèi)組分，并計(jì)算油污土壤中烴類(lèi)組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

色譜條件：高純N2為載氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；進(jìn)樣方式為不分流；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃保持5 min，以升溫速率 6 ℃/min 升溫至300 ℃并保持20 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源，離子源溫度280 ℃，采用全掃描(SCAN) 模式。土壤樣品中烴類(lèi)組分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))計(jì)算方法如式(1)～(3)所示[20]。

(1)

(2)

(3)

式中：FRR(Relative response factor)為相對(duì)響應(yīng)因子；AC0和AC1為標(biāo)準(zhǔn)樣品和所測(cè)樣品中組分峰面積；AI0和AI1為標(biāo)準(zhǔn)樣品和所測(cè)樣品中內(nèi)標(biāo)峰面積；mC0和mC1為標(biāo)準(zhǔn)樣品和所測(cè)樣品中組分質(zhì)量，g；mI0和mI1為標(biāo)準(zhǔn)樣品和所測(cè)樣品中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量，g；n為稀釋倍數(shù)；V1為所測(cè)樣品體積，mL；V2為油污土壤萃取液總體積，mL；mT為土壤的質(zhì)量，g；wT為土壤中組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g/g。

1.4 高通量測(cè)序及統(tǒng)計(jì)分析

將采集的新鮮土壤樣品進(jìn)行脫氧核糖核酸(DNA)提取和高通量測(cè)序。采用分光光度計(jì)(Nanodrop)進(jìn)行紫外定量檢測(cè)總DNA，采用Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并采用AXYGEN公司生產(chǎn)的凝膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣品的測(cè)序量需求，對(duì)各樣品按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。最后，采用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)土壤樣品真菌、細(xì)菌、古菌群落DNA片段進(jìn)行雙端測(cè)序。使用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST這一序列比對(duì)工具，對(duì)前述獲得的序列按照97%的序列相似度進(jìn)行歸并和可操作分類(lèi)單元(Operational taxonomic unit，OTU)劃分，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。使用QIIME軟件，獲取各樣品在門(mén)、綱、目、科、屬5個(gè)分類(lèi)水平上的組成和豐度分布表。通過(guò)主成分分析研究樣品Beta多樣性，對(duì)群落數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行自然分解并通過(guò)對(duì)樣品排序，觀測(cè)樣品之間的差異。

采用Chao1豐富度指數(shù)、ACE豐富度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)來(lái)反映其Alpha多樣性，使用QIIME軟件分別對(duì)每個(gè)樣品計(jì)算上述4種多樣性指數(shù)。使用R軟件，對(duì)豐度前50位的屬進(jìn)行聚類(lèi)分析并繪制熱圖。分析油污土壤微生物群落與土壤烴類(lèi)組分的相關(guān)性，將各樣品群落按照門(mén)及屬水平分別進(jìn)行整理，分析群落組成受石油污染的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 油污土壤基本性質(zhì)

圖1為油污土壤樣品的粒徑分布。根據(jù)土壤的分類(lèi)和定名標(biāo)準(zhǔn)[21]，YGQ0-20、YGQ20-50、WYC0-20、WYC20-50、LJC0-20為粗砂，LJC20-50為中砂。表1為油污土壤的基本性質(zhì)。由表1可以看出，YGQ0-20土壤樣品含水率最低，僅為1.35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，其次為WYC0-20，含水率為14.25%，其余土壤樣品含水率均在20%以上。從土壤pH值可以看出，LJC0-20和LJC20-50為弱堿性土壤，其余樣品為中性土壤，油污程度對(duì)pH值沒(méi)有明顯的影響。WYC0-20土壤樣品中油質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為8.632 g/kg，其次為L(zhǎng)JC0-20；YGQ取樣點(diǎn)油含量明顯低于WYC、LJC兩點(diǎn)，YGQ20-50油含量最低；油污土壤樣品的油含量與有機(jī)質(zhì)含量呈正比關(guān)系。土壤有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6～14.0 mg/kg，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9～79 mg/kg，且油含量與有效磷含量和全氮含量無(wú)明顯的相關(guān)性。

≥2 mm; 2-0.9 mm; 0.9-0.6 mm; 0.6-0.5 mm; 0.5-0.45 mm; 0.45-0.1 mm; 0.1-0.08 mm; ≤0.075 mm圖1 油污土壤樣品粒徑分布Fig.1 Particle size distributions of oil-contaminated soil samples

表1 油污土壤基本性質(zhì)Table 1 Properties of oil-contaminated soil samples

F1—Normal paraffin; F2—Aromatic hydrocarbonsA—Anthracene; B—Benzene; C—Chrysene; D—Dibenzothiophene; F—Fluorene; N—Naphthalene; P—Phenanthrene; I—Pyrene圖2 油污土壤中烴類(lèi)組分含量分布Fig.2 Hydrocarbons mass fraction in oil-contaminated soil samples(a) YGQ-F1; (b) YGQ-F2; (c) WYC-F1; (d) WYC-F2; (e) LJC-F1; (f) LJC-F2

綜上所述，可以認(rèn)為油污土壤中正構(gòu)烷烴碳數(shù)范圍主要分布在C13～C32，同一取樣點(diǎn)上層土壤中碳數(shù)范圍在C16～C21的正構(gòu)烷烴含量較高，而下層土壤中C22～C30的正構(gòu)烷烴含量較高。上層土壤中芳香烴的種類(lèi)和含量明顯高于下層土壤。

2.2 油污土壤中微生物群落多樣性指數(shù)分析

2.2.1 油污土壤的微生物群落豐富度及多樣性

6個(gè)土壤樣品通過(guò)質(zhì)量篩查，且Index完全匹配時(shí)共獲得272199條有效ITS序列、227067條有效細(xì)菌序列、210468條有效古菌序列。將以97%的序列相似度作為OTU劃分和分類(lèi)地位鑒定，此次測(cè)序結(jié)果可劃分為845個(gè)真菌OTU、5444個(gè)細(xì)菌OTU及451個(gè)古菌OTU(分類(lèi)至屬水平)。圖3為不同油含量的油污土壤中微生物群落的OTU數(shù)量。從圖3可以看出，微生物群落OTU數(shù)量隨著油污土壤油含量增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，這說(shuō)明石油為微生物的生長(zhǎng)提供了豐富的碳源，但當(dāng)土壤中油質(zhì)量分?jǐn)?shù)(即污染程度)高于8.632 g/kg時(shí)，則會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)。

圖3 不同油含量的油污土壤中微生物群落的可操作分類(lèi)單元(OTU)數(shù)量Fig.3 Operational taxonomic unit (OTU) number of the microbial communities in the oil-contaminatedsoil samples with different oil contents

對(duì)于微生物群落而言，有多種指數(shù)來(lái)反映其Alpha多樣性。常用的度量指數(shù)主要包括側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，以及兼顧群落均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。一般而言，Chao1或ACE指數(shù)越大，表明微生物群落的豐富度越高；Simpson指數(shù)降低，表明微生物群落的多樣性降低，Shannon指數(shù)越高，表明微生物群落的均一性越高。表2為不同油污土壤樣品的真菌、細(xì)菌、古菌群落的多樣性指數(shù)。根據(jù)Chao1或ACE指數(shù)可知，油污土壤樣品真菌群落的豐富度由大到小順序?yàn)長(zhǎng)JC0-20、YGQ20-50、 LJC20-50、WYC20-50、 WYC0-20、YGQ0-20；其細(xì)菌群落的豐富度由大到小順序?yàn)閅GQ20-50、 LJC20-50、 WYC20-50、WYC0-20、LJC0-20、YGQ0-20；其古菌群落的豐富度由大到小順序?yàn)長(zhǎng)JC0-20、LJC20-50、WYC20-50、YGQ20-50、WYC0-20、YGQ0-20。根據(jù)Shannon和Simpson指數(shù)可得，油污土壤樣品真菌群落的多樣性由大到小順序?yàn)長(zhǎng)JC20-50、YGQ20-50、LJC0-20、WYC20-50、WYC0-20、YGQ0-20；其細(xì)菌群落的多樣性由大到小順序?yàn)閅GQ20-50、LJC0-20、LJC20-50、WYC20-50、WYC0-20、YGQ0-20；其古菌群落的多樣性由大到小順序?yàn)長(zhǎng)JC0-20、WYC20-50、LJC20-50、YGQ20-50、YGQ0-20、WYC0-20?？梢钥闯觯篩GQ0-20和WYC0-20樣品群落的豐富度和多樣性均較差；這可能是因?yàn)閅GQ0-20含水率過(guò)低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.35%)，影響了微生物群落的豐富度和多樣性；WYC0-20土壤樣品中油質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高(8.632 g/kg)，抑制了微生物生長(zhǎng)，從而影響了其豐富度和多樣性。

2.2.2 油污土壤的Beta多樣性分析

使用R軟件對(duì)加權(quán)(Weighted)的UniFrac距離矩陣進(jìn)行非度量多維尺度分析(NMDS)，通過(guò)二維排序圖描述群落樣品的結(jié)構(gòu)分布(結(jié)果如圖4所示)，每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)樣本，不同顏色的點(diǎn)屬于不同樣本(組)，2點(diǎn)之間的距離越近，表明2個(gè)樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度越高，差異越小。從圖4(a)可以看出，對(duì)于真菌群落，WYC和LJC取樣點(diǎn)分布較為分散，而YGQ0-20和YGQ20-50距離較近，表明兩者的群落構(gòu)成差異較小。從圖4(b)可以看出：對(duì)于細(xì)菌群落，油含量最低的YGQ20-50距離其他取樣點(diǎn)較遠(yuǎn)，群落構(gòu)成的差異也較大；而WYC0-20、WYC20-50、LJC0-20和LJC20-50油含量相近，群落相似性也較高。由圖4(c) 可以看出，對(duì)于古菌群落，油含量最低的YGQ20-50和最高的WYC0-20距離較遠(yuǎn)，群落結(jié)構(gòu)差異性也較大。由此可以認(rèn)為，油污土壤中微生物群落的Beta多樣性與其受石油污染程度有一定的關(guān)系，油含量相近的油污土壤樣品，其微生物群落結(jié)構(gòu)的相似度較高。Natsuko等[22]釆集美國(guó)不同油污地區(qū)的土壤進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)油含量相近的土壤微生物種群差異不大。賈建麗等[23]分別采集中國(guó)不同地區(qū)的5個(gè)油田的油污土壤，研究微生物群落結(jié)構(gòu)，也得出了相似的結(jié)果。

表2 不同油污土壤樣品真菌、細(xì)菌、古菌群落的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of fungi, bacteria, archaea community in different oil-contaminated soil samples

NMDS—Nonmetric multidimensional scaling圖4 油污土壤中微生物群落的NMDS分析Fig.4 NMDS analysis of microbial community in oil contaminated soil(a) Fungi; (b) Bacteria; (c) Archaea

2.3 油污土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

圖5為油污土壤微生物群落在門(mén)水平上的相對(duì)豐度(土壤微生物群落相對(duì)豐度=單個(gè)物種的絕對(duì)豐度/整個(gè)種群豐度總量)。從圖5(a)可以看出：土壤真菌群落主要隸屬于子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)等9個(gè)門(mén)；其中，子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度最大，為54.4%～83.2%；其次為擔(dān)子菌門(mén)，相對(duì)豐度為6.8%～35.5%。已有研究認(rèn)為能夠降解PAHs的真菌一般多見(jiàn)于子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)等[24]。陳銳等[15]在研究安塞石油污染區(qū)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)，在門(mén)水平上子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為土壤樣品的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。

由圖5(b)可見(jiàn)，土壤樣品細(xì)菌群落主要隸屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、螺旋體菌門(mén)(Saccharibacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)等20個(gè)門(mén)。其中，相對(duì)豐度最高的為變形菌門(mén)，為44.8%～79.5%。梁建芳等[13]通過(guò)研究表明，克拉瑪依油田石油污染土壤細(xì)菌主要屬于變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和浮霉?fàn)罹T(mén)。劉臻證明厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)可以石油烴為碳源進(jìn)行代謝，藍(lán)細(xì)菌門(mén)在石油污染的水體中能夠很好地利用石油烴作為碳源并維持生長(zhǎng)[25]。在對(duì)大港油田土壤模擬生物修復(fù)過(guò)程中同樣發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、放線菌門(mén)和酸桿菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度為84.47%～94.66%[26]。

由圖5(c)可見(jiàn)，土壤樣品古菌群落主要隸屬于奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)、廣域古菌門(mén)(Euryarchaeota)、深古菌門(mén)(Bathyarchaeota)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等13個(gè)門(mén)。相對(duì)豐度最大的為奇古菌門(mén)，為28.3%～93.1%；廣域古菌門(mén)的相對(duì)豐度為0.2%～47.3%。宋震等[27]研究表明，原油和含油廢水污染土壤樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是廣域古菌門(mén)，含油廢水和原油都促進(jìn)了土壤中廣域古菌門(mén)的生長(zhǎng)和發(fā)育，而石油污染程度較輕的土壤樣品中，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是奇古菌門(mén)。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，石油污染程度較重的WYC0-20、LJC0-20及LJC20-50土壤樣品中，廣域古菌門(mén)相對(duì)豐度明顯高于其他樣品，而污染程度較輕的YGQ0-20和YGQ20-50樣品奇古菌門(mén)的相對(duì)豐度更大。

圖5 油污土壤微生物群落門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of the microbial community phyla in oil contaminated soil samples(a) Fungi; (b) Bacteria; (c) Archaea

2.4 油污土壤微生物屬水平上的物種聚類(lèi)分析

圖6為不同油污土壤中微生物屬水平上的物種聚類(lèi)圖(紅色代表在對(duì)應(yīng)樣品中豐富度較高的屬，綠色代表豐富度較低的屬)。石油污染程度和土壤深度變化會(huì)使土壤中優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化，這是由于土壤深度變化和土壤石油污染導(dǎo)致土壤中氧含量、壓力以及營(yíng)養(yǎng)元素發(fā)生了變化[25]。從圖6(a)可以看出：污染程度最重的WYC0-20土壤樣品中真菌踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、Phaeoacremonium、柱霉屬(Scytalidium)、絲孢菌屬(Scedosporium)、赭霉屬(Ochroconis)、Sagenomella、念珠菌屬(Candida)相對(duì)豐度較大；這些菌屬在污染程度較輕的YGQ0-20和YGQ20-50土壤樣品中相對(duì)豐度較低。而YGQ0-20中豐度較大的刺杯毛孢屬(Dinemasporium)、青霉屬(Penicillium)、外瓶霉屬(Exophiala)以及YGQ20-50中豐度較大的尾梗霉屬(Cercophora)、柄孢殼屬(Zopfiella)、鐮狀瓶霉屬(Harpophora)在WYC、LJC土壤樣品中豐度較低。WYC0-20土壤樣品中踝節(jié)菌屬的相對(duì)豐度由0提高到31.6%，而青霉屬的相對(duì)豐度顯著降低，由44.9%降至0.1%。這說(shuō)明青霉屬可在石油污染環(huán)境中生存，但污染程度過(guò)高(土壤中油質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.632 g/kg)時(shí)不利于其生存。研究人員從油污土壤或海洋環(huán)境中分離出的具有原油降解能力的真菌中就包括踝節(jié)菌屬[28]。另外，有報(bào)道稱(chēng)曲霉屬(Aspergillus)對(duì)原油中C11～C20的烴鏈有較好的降解作用，外瓶霉屬可降解甲苯、多環(huán)芳烴類(lèi)污染物，青霉屬和莖點(diǎn)霉屬(Phoma)可降解PAHs，念珠菌屬對(duì)正構(gòu)烷烴降解效果較好[24,29]。

從圖6(b)可以看出，對(duì)于細(xì)菌，污染程度較輕的YGQ0-20中豐度較大的鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和YGQ20-50中豐度較大的變異桿菌屬(Variibacter)、固氮弓菌屬(Azoarcus)在WYC、LJC土壤樣品中豐度較低。污染程度最重的WYC0-20中豐度較大的屬有寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)。其中，寡養(yǎng)單胞菌的相對(duì)豐度由0.1%提升到1.9%，而甲基桿菌屬由10.7%降到0.3%。肖建軍等[30]通過(guò)在石油污染的土壤中篩選出寡養(yǎng)單胞菌并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)甲苯有較好的去除效果。土壤樣品中細(xì)菌屬水平豐度較高的分枝桿菌(Mycobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)都是能夠降解石油烴的細(xì)菌菌屬[25]。

從圖6(c)可以看出，對(duì)于古菌，各取樣點(diǎn)高豐度交叉菌屬較少。污染程度最輕的YGQ0-20中豐度較大的屬有甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)。而污染程度最重的WYC0-20中豐度最高的屬有甲烷桿菌屬、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)和甲烷囊菌屬(Methanoculleus)。其中，甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度由5.8%增至37.8%。有文獻(xiàn)表明，產(chǎn)甲烷古菌對(duì)石油烴具有厭氧生物降解作用[31]，甲烷八疊球菌屬具有降解C12～C30的長(zhǎng)鏈正構(gòu)烷烴的能力[32]。

2.5 油污土壤微生物群落與土壤烴類(lèi)組分的相關(guān)性

BEN—Benzene; NAP—Naphthalene; PHE—Phenanthrene; PYR—Pyrene; CHR—Chrysene;ANT—Anthracene; FLU—Fluorene; DBT—Dibenzothiophene圖7 油污土壤微生物群落與烴類(lèi)組分含量的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of microbial community and hydrocarbon components in oil contaminated soil samples(a) Alkanes; (b) Aromatic hydrocarbons

3 結(jié) 論

(1)東營(yíng)某煉油廠石油污染土壤中細(xì)菌、真菌和古菌的群落OTU數(shù)量隨著土壤油含量的增加先增多后減少，群落結(jié)構(gòu)的Beta多樣性指數(shù)與土壤油含量有一定相關(guān)性，受污染程度相近的土壤樣品，其微生物群落結(jié)構(gòu)的相似度較高。

(2)油污土壤樣品真菌群落中子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)的相對(duì)豐度最大；細(xì)菌群落中相對(duì)豐度最高的為變形菌門(mén)(Proteobacteria)；古菌群落中相對(duì)豐度最大的為奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)和廣域古菌門(mén)(Euryarchaeota)。隨著土壤油含量增加，真菌踝節(jié)菌屬(Talaromyces)的相對(duì)豐度由0提高到31.6%；細(xì)菌寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)由0.1%提升到1.9%；古菌群落中甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)的相對(duì)豐度由5.8%增至37.8%。

(3)微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤中烴類(lèi)組分含量相關(guān)性分析表明，真菌炭疽菌屬(Colletotrichum)、細(xì)菌節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假枝桿菌(Pseudoclavibacter)、古菌鹽紅菌屬(Halorubrum)與烷烴含量呈顯著正相關(guān)性，而真菌柄孢殼屬(Zopfiella)、古菌擬桿菌屬(Bacteroides)與烷烴含量呈顯著負(fù)相關(guān)性；細(xì)菌甲基桿菌屬(Methylobacterium)和古菌甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)、擬桿菌屬(Bacteroides)與芳烴含量呈正相關(guān)性，真菌腐殖霉屬(Humicola)和被孢霉屬(Mortierella)與芳烴含量呈顯著負(fù)相關(guān)。