王劍飛，韓俊海，張子超

孤獨(dú)癥譜系障礙小鼠模型行為學(xué)檢測方法

王劍飛，韓俊海，張子超

東南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，發(fā)育與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室，南京 210096

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)是一種遺傳相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性疾病，患者主要呈現(xiàn)社交缺陷、溝通障礙、重復(fù)刻板行為和學(xué)習(xí)記憶障礙等核心癥狀。小鼠模型是探究孤獨(dú)癥譜系障礙的致病機(jī)理和尋找潛在治療方法的重要工具，而小鼠行為學(xué)的觀測和分析可以幫助人們更好地了解不同遺傳操作對相應(yīng)孤獨(dú)癥表型的影響，從而闡釋疾病機(jī)理。本文列舉了針對孤獨(dú)癥患者核心缺陷的相關(guān)小鼠行為學(xué)分析方法，包括檢測社交缺陷的三廂社交實驗、居住者–入侵者實驗、筑巢實驗和超聲波檢測；檢測重復(fù)刻板行為的Y迷宮自主選擇實驗、捋毛實驗、刻板行為分析實驗和彈珠埋藏實驗；檢測焦慮行為的曠場實驗、高架十字迷宮實驗和明暗穿梭實驗；檢測學(xué)習(xí)和記憶障礙的新事物選擇實驗和水迷宮實驗。本文詳細(xì)描述了這些行為學(xué)實驗的標(biāo)準(zhǔn)操作流程、注意事項以及規(guī)范的數(shù)據(jù)分析方法，可以幫助研究人員進(jìn)行相關(guān)實驗設(shè)計。同時本文對已知孤獨(dú)癥小鼠遺傳模型中的各項行為學(xué)表型進(jìn)行了匯總和比較，為相關(guān)研究人員提供系統(tǒng)參照。

孤獨(dú)癥譜系障礙；小鼠行為學(xué)分析；社交障礙；重復(fù)刻板；學(xué)習(xí)記憶；焦慮

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)是一類發(fā)病率達(dá)1%[1]的高發(fā)兒童神經(jīng)發(fā)育障礙疾病，近年來呈增長趨勢，因其對家庭和社會生活的影響而引起了廣泛關(guān)注。絕大多數(shù)孤獨(dú)癥患者具有典型的語言障礙以及重復(fù)刻板行為，運(yùn)動機(jī)能低下并常伴隨有嚴(yán)重的肌肉緊張癥，在學(xué)習(xí)、交流和生活方面存在諸多障礙。此外，大部分患者會有各種并發(fā)疾病，包括智力障礙(約45%)、兒童注意力缺陷多動癥(28%~44%)、抽搐性運(yùn)動障礙(14%~38%)、胃腸性問題(9%~70%)、免疫失調(diào)(<38%)、焦慮(42%~56%)、沮喪(12%~70%)、強(qiáng)迫癥狀(19%~32%)，以及自殘行為(<50%)等[2]。

ASD的致病機(jī)理復(fù)雜，涉及遺傳和環(huán)境因素等多方面因素。約有25%的患者是由遺傳原因?qū)е耓3]，目前研究已發(fā)現(xiàn)了超過102個孤獨(dú)癥相關(guān)基因[4]。除此以外，由于暴露在重金屬、阻燃劑、殺蟲劑、用于乙烯基和化妝品的鄰苯二甲酸鹽、以及細(xì)菌或病毒感染等環(huán)境也會導(dǎo)致ASD[5]。為了探究ASD的致病機(jī)理和尋找潛在的治療方法，研究者們已經(jīng)建立起了多種小鼠模型：(1)通過特定藥物誘發(fā)產(chǎn)生ASD模型，如丙酸(PPA)模型和丙戊酸(VPA)模型；(2)直接利用行為學(xué)方法等篩選出既有典型ASD癥狀，如近交系 BTBR-T+tf/J和BALB/cByJ小鼠模型；(3)最重要的是利用基因改造獲得的大量ASD模型，如基因敲除/敲入、和的基因敲除模型等[6]。這些基因工程小鼠模型在國內(nèi)可以從上海南方模式動物中心和集萃藥康等平臺獲取，科研人員可以從整體水平研究基因或者生化因素在ASD病理中的作用，從分子、細(xì)胞、組織和行為學(xué)不同層次進(jìn)行分析，觀察干預(yù)療效，這對于闡釋疾病機(jī)理和研究治療方法至關(guān)重要。

本文匯總了針對社交行為、重復(fù)刻板行為、焦慮和學(xué)習(xí)記憶等研究常用的小鼠行為學(xué)分析方法，詳細(xì)介紹了各種方法的實驗原理、裝置、操作以及數(shù)據(jù)記錄分析等內(nèi)容，并總結(jié)了已知孤獨(dú)癥基因工程小鼠模型中的相關(guān)行為學(xué)表型，希望為擬開展相關(guān)ASD研究人員提供實驗設(shè)計和實施的具體參考。

1 材料和方法

1.1 小鼠及飼養(yǎng)條件

行為學(xué)實驗中大多采用3~4月齡(誘導(dǎo)分離超聲波檢測為出生后的幼崽)的雄性同窩小鼠，之前沒有進(jìn)行過任何行為測試。小鼠均在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)于購自蘇州楓橋凈化公司的普通飼養(yǎng)籠，行為學(xué)實驗需在安靜的恒溫封閉房間進(jìn)行，行為測定要在光周期內(nèi)完成。行為測試裝置包括各種行為箱及配套設(shè)備和視頻分析系統(tǒng)(SuperMaze)等可以從上海欣軟公司購買。

1.2 三廂社交實驗

三廂社交實驗(three-chamber social test)：2004年Crawley等[7]根據(jù)小鼠的群居性和社會性以及形成一定社交記憶的原理，開發(fā)出自動化的三廂社交實驗，可以直接自動化的測量小鼠社交行為，并對實驗結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和高通量的分析。三廂社交實驗的基礎(chǔ)是正常小鼠具有社交能力，當(dāng)面對同類時，會更愿意和同類小鼠接觸，而不是單處一室；當(dāng)出現(xiàn)陌生的同類時，正常小鼠能把它和熟悉的同伴區(qū)分開來，更多的和陌生個體接觸，表現(xiàn)出社交新穎性。

三廂社交行為箱整體為敞口的長方體，中間被兩塊醫(yī)用有機(jī)擋板均分為3個獨(dú)立小室，每個擋板下方均有一個可控制開關(guān)的小門方便小鼠自由進(jìn)出各室。左右兩室的角落各有一個鐵質(zhì)的網(wǎng)格狀束縛器，束縛放入其中的小鼠。實驗前兩天，將待測小鼠放入行為房飼養(yǎng)使小鼠熟悉測試環(huán)境，減少小鼠因環(huán)境差異而造成的實驗誤差；實驗時，通常在較暗的環(huán)境中進(jìn)行，行為箱內(nèi)光照可以維持在40 lux，溫度保持在24℃，實驗人員避免出現(xiàn)在小鼠的視線之內(nèi)，并減少噪音的產(chǎn)生，維持環(huán)境音量在30 dB以下，保持安靜；每只小鼠實驗結(jié)束用70%酒精去除行為箱內(nèi)氣味和異物，并用衛(wèi)生紙擦拭干凈。

實驗分為3個階段：(1)適應(yīng)階段：將實驗小鼠背朝實驗者放入行為箱的中央室，打開左右擋板的小門使其自由活動10 min，充分熟悉環(huán)境；(2)社交能力檢測：10 min后將小鼠重新放至中央室，關(guān)閉左右擋板的小門并在左右兩室的束縛器中隨機(jī)放入一只同種相似年齡段的小鼠(stranger 1)，另一個保持空置(empty)，打開左右擋板的小門使其自由活動10 min并記錄；(3)社交新穎性檢測：10 min后將小鼠重新放至中央室，關(guān)閉左右擋板的小門，取出stranger 1再次隨機(jī)放入到任一束縛器中，然后在另一束縛器中放入另一只同種相似年齡段的小鼠(stranger 2)，打開左右擋板的小門使其自由活動10 min (圖1)并記錄。實驗結(jié)束將小鼠放回飼養(yǎng)籠，清洗行為箱，統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)。

1.3 居住者–入侵者實驗

居住者–入侵者實驗(resident-intruder test)：同一物種成員之間的社會沖突來產(chǎn)生情感和心理壓力，讓失敗者產(chǎn)生社交挫敗，失敗者會有生理和行為變化[8]。小鼠天生具有領(lǐng)地意識會攻擊外來侵入者，研究人員發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計實驗中居住者的攻擊性行為和非攻擊性的社交行為可以模擬孤獨(dú)癥患者的暴力傾向和社交缺陷。

實驗使用常規(guī)的透明飼養(yǎng)籠(30 cm×17 cm× 16 cm)即可檢測小鼠的社交行為。實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同，實驗通常分為兩個階段：(1)實驗前將待測鼠(居住者)和標(biāo)準(zhǔn)的非進(jìn)攻鼠(入侵者：年齡相仿，體型和體重與待測小鼠相仿或略低)單獨(dú)飼養(yǎng)一周，培養(yǎng)它們的領(lǐng)地意識。為了增強(qiáng)領(lǐng)地意識，也可以引進(jìn)同窩雌鼠共同飼養(yǎng)；(2)實驗時保持待測小鼠籠內(nèi)環(huán)境不變(若有雌鼠則在實驗前24 h取出)，將標(biāo)準(zhǔn)的非進(jìn)攻鼠作為入侵者放入，記錄并統(tǒng)計10 min內(nèi)小鼠的行為表現(xiàn)(圖2A)并記錄。實驗連續(xù)4 d，每天選取同一時間實驗、記錄和觀察。

圖1 三廂社交實驗

1.4 筑巢實驗

筑巢實驗(nesting test)：群居小鼠通過筑巢來保溫和防御，其筑巢能力與母性行為、家庭社交行為和繁殖等因素有關(guān)，具有社會交流的性質(zhì)。2006年Deacon等[9,10]在初級巢穴評級基礎(chǔ)上(0：沒有巢；1：平巢；2：巢蓋住小鼠)制定了更加精細(xì)的5分巢穴評分表，廣泛應(yīng)用于小鼠社交行為檢測。

實驗在常規(guī)飼養(yǎng)條件下的透明飼養(yǎng)籠(30 cm× 17 cm×16 cm)中即可檢測小鼠的社交行為。在正常的光周期(時間為7: 00~19: 00光照，19: 00~7: 00黑暗)和溫濕度(溫度保持在26℃，濕度保持在40%~70%)的飼養(yǎng)房中，下午6時將一定量的筑巢材料(片狀、屑狀、條狀的木質(zhì)和紙質(zhì)材料最佳，避免使用棉質(zhì)材料，防止纖維狀的棉絮阻礙小鼠行動和損傷小鼠眼睛[11])放入鼠籠，并給予充足的食物與水。第二天早上7點觀察筑巢結(jié)果，小鼠筑巢過程中避免實驗人員進(jìn)出鼠房，保持安靜的環(huán)境，避免打擾小鼠筑巢。

1.5 超聲波發(fā)聲檢測實驗

超聲波發(fā)聲(ultrasonic vocalizations, USVs)：USVs被小鼠用來傳遞情緒狀態(tài)相關(guān)信息進(jìn)行互動和交流，與小鼠社會行為密切相關(guān)。目前3種類型的USVs在實驗室小鼠中得到了大量研究：幼崽隔離誘導(dǎo)產(chǎn)生的USVs、青年小鼠社會交流產(chǎn)生的USVs和成年小鼠社交互作產(chǎn)生的USVs。Premoli等[12]歸納描述了小鼠幼崽與母親分離時發(fā)出的USVs并認(rèn)為其促進(jìn)了母親和子女之間的社會交流；Panskepp等[13]發(fā)現(xiàn)USVs在青年小鼠中與社會互作和運(yùn)動水平相關(guān)；Egnor等[14]認(rèn)為成年小鼠求偶和交配時產(chǎn)生的USVs在社會、性行為中具有重要作用。

圖2 居住者–入侵者實驗

A：實驗設(shè)置示意圖；B：小鼠攻擊性行為(上)和非攻擊性社交(下)示例。

隔離誘導(dǎo)USVs是幼崽在與母親分離時發(fā)出的求救叫聲，代表著幼崽與母親之間的聲音交流行為，這種行為被認(rèn)為與ASD有關(guān)，在ASD小鼠模型中幼崽表現(xiàn)出USVs釋放受損或呼叫模式異常。

實驗采用SONOTRACK超聲波監(jiān)測系統(tǒng)，其主要由測量箱和控制器兩部分組成。測量箱可充分隔音且內(nèi)層有專用隔音棉減少回聲，箱內(nèi)空間可以放置標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼養(yǎng)籠。每個測試箱內(nèi)還包含有易安裝且能夠收集全段超聲信號的敏度麥克風(fēng)、超低噪音放大器、整套LED照明設(shè)備和低噪音通風(fēng)設(shè)備?？刂破骺刂普麄€測量箱照明、通風(fēng)以及進(jìn)行實驗記錄，并與系統(tǒng)相連進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

實驗前，保持幼崽和母鼠的生活環(huán)境不變。實驗時在出生后的2、4、6、8、12日將幼崽從母鼠身邊分離，放置在測量箱內(nèi)一個直徑5 cm、高度10 cm的空塑料容器中；測量幼崽的體溫，并保持測量箱內(nèi)溫度恒定為21℃；將麥克風(fēng)通過測量箱蓋中的小孔固定安裝，離幼崽上方約20 cm，記錄并統(tǒng)計5 min內(nèi)幼崽發(fā)出的USVs；錄音結(jié)束后，再次測量幼崽的體溫，實驗前后應(yīng)保持幼崽體溫一致，避免因寒冷導(dǎo)致記錄的USVs差異；實驗結(jié)束后利用70%的酒精擦洗測量箱，并開始下一組實驗[15]。

求偶則是成年小鼠社交互動的一種表現(xiàn)形式，雄鼠在面對成年雌鼠或其氣味時會釋放大量的USVs，吸引雌鼠注意并增加求偶的成功率[16]。社交缺陷會影響雄鼠在求偶過程中的USVs釋放，在ASD小鼠模型中，雄鼠會表現(xiàn)出USVs釋放受損或呼叫模式異常。

實驗同樣采用SONOTRACK超聲波監(jiān)測系統(tǒng)，實驗前將待測的雄鼠在單獨(dú)的飼養(yǎng)籠中隔離飼養(yǎng)5 d，并將其放置在行為房熟悉環(huán)境；實驗當(dāng)天檢查相同基因型的陌生雌鼠的陰道，選取發(fā)情期的雌鼠為引入對象；實驗時將飼養(yǎng)籠放置入測量箱，固定麥克風(fēng)距雄鼠上方約20 cm，然后將發(fā)情的雌鼠引入被隔離的雄鼠飼養(yǎng)籠，記錄并統(tǒng)計5 min內(nèi)雄鼠發(fā)出的USVs；實驗結(jié)束后利用70%的酒精擦洗測量箱，并開始下一組實驗。

1.6 Y-迷宮自發(fā)選擇實驗

Y-迷宮自主選擇實驗(Y maze spontaneous selec-tion test)：依據(jù)小鼠具有探索新環(huán)境的天性，1976年Olten等[17]開發(fā)了Y迷宮用于測量大鼠的特殊學(xué)習(xí)和記憶能力。在ASD模型中，小鼠如果認(rèn)定環(huán)境和事物后很難做出改變就被認(rèn)為具有重復(fù)刻板的偏執(zhí)性行為[18]。

Y-迷宮由3條等長的支臂(35 cm×5 cm×15 cm)和一個連接區(qū)組成，每兩條臂之間的夾角均為120°，3條臂交匯處的連接區(qū)有可供打開的小門，方便小鼠自由進(jìn)出。

實驗前預(yù)處理和實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同。實驗時：(1)先任選一條臂作為起始臂，將小鼠背對實驗者面向迷宮中心輕輕放入，打開門，當(dāng)小鼠選擇進(jìn)入一條臂的時候，關(guān)閉門，使小鼠在其中自由活動5 min，并將小鼠進(jìn)入的臂記作目標(biāo)臂，另一條臂記作非目標(biāo)臂[19]；(2)將小鼠重新放入起始臂，打開門，記錄小鼠進(jìn)入的臂；(3)重復(fù)(2)中操作20次，記錄并統(tǒng)計小鼠進(jìn)入目標(biāo)臂和非目標(biāo)臂的次數(shù)(圖3)。

1.7 捋毛實驗

捋毛實驗 (grooming)：小鼠具有梳理毛發(fā)的天性，在梳理行為中，Berridge和Bursten等[20,21]首先揭示了小鼠復(fù)雜的固定梳理動作模式，并在一種松鼠()中，將其儀式化為一種刻板的展示，隨后梳理毛發(fā)作為反應(yīng)重復(fù)刻板行為的指標(biāo)廣泛適用于孤獨(dú)癥小鼠模型中。常見的捋毛動作包括前肢梳理、摩擦清洗顏面、身體腹側(cè)、尾部和生殖器清理(圖4，A~C)等。

圖3 Y-迷宮自主選擇實驗

實驗使用常規(guī)的飼養(yǎng)籠即可檢測小鼠的重復(fù)刻板行為。實驗前預(yù)處理和實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同。實驗時小鼠置于30×17×16 cm干凈透明的飼養(yǎng)籠中，給與充足的食物和水讓其自由探索10 min；10 min后打開攝像頭，記錄30 min內(nèi)小鼠在籠子里自由活動數(shù)據(jù)。每次試驗之間，用70%的乙醇清洗開闊的場地。

1.8 其他刻板行為分析實驗

刻板行為分析(stereotyped behavior analysis test)：刻板行為被認(rèn)為是孤獨(dú)癥譜系障礙的核心癥狀之一。具體的刻板行為表征最早是從Kanner[22]描述的11名兒童開始為人所知，而在ASD小鼠模型中也觀察到一系列刻板行為檢測，包括高水平的轉(zhuǎn)圈、空翻、后肢站立、垂直跳躍、重復(fù)的前肢運(yùn)動、咀嚼墊料或無意義咀嚼、搖頭和嗅探同一位置等[23]。

實驗前預(yù)處理和實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同。實驗時將小鼠置于30 cm×17 cm×16 cm干凈透明的飼養(yǎng)籠中，鋪上墊料并給與充足的食物和水讓其自由探索10 min；10 min后打開攝像頭，記錄30 min內(nèi)小鼠在籠子里自由活動數(shù)據(jù)。每次試驗之間，用70%的乙醇清洗開闊的場地。

1.9 彈珠埋藏實驗

彈珠埋藏實驗(marble-burying tests)：挖掘和掩埋是小鼠的一種典型行為，實驗最初用于評估嚙齒類動物的焦慮行為，但2009年Thomas等[24,25]更偏向于其為測量重復(fù)性或強(qiáng)迫性挖掘行為的測試，并可以定量地檢測ASD小鼠模型中重復(fù)刻板行為。

實驗前預(yù)處理和實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同。實驗時將新鮮無味的墊料加入到嶄新的飼養(yǎng)籠中(30 cm×17 cm×16 cm)，深度為5 cm，并將墊料壓平壓實；將標(biāo)準(zhǔn)玻璃彈珠(各種款式和顏色，直徑約為2 cm，重量約為5 g)，按5排每排4彈珠等距離地輕放在墊料上(圖5)；打開攝像頭，記錄30 min內(nèi)小鼠的運(yùn)動情況。每次實驗之間，更換鼠籠和墊料，并用溫和的洗滌劑清洗彈珠，蒸餾水徹底沖洗，使用前晾干。

1.10 曠場實驗

曠場實驗(open field test)：將動物置于一個被周圍墻壁阻止逃跑的未知環(huán)境，是一種被廣泛應(yīng)用的類焦慮行為模型，起初為了評估動物情緒而開發(fā)，隨后也被Archer等[26,27]用于檢測動物的行為運(yùn)動能力。曠場實驗中，小鼠具有畏懼空曠場地而進(jìn)行躲避的天性，而另一方面又會對空曠中心產(chǎn)生探究的好奇心理，兩者沖突從而引發(fā)焦慮。

實驗使用曠場行為箱檢測小鼠自發(fā)活動行為，探索行為和焦慮。行為箱整體為40 cm×40 cm×40 cm敞口的正方體，實驗前預(yù)處理和實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同。實驗時將小鼠背朝實驗人員放入行為箱(圖6A)的正中心，讓其自由探索10 min；10 min后打開攝像頭，記錄10 min內(nèi)小鼠在行為箱內(nèi)自由活動數(shù)據(jù)(圖6B)，每次試驗之間，用70%的乙醇清洗行為箱。

圖4 小鼠捋毛行為

A：清洗顏面；B：清理前肢；C：尾部清理。

圖5 彈珠埋藏實驗

圖6 曠場實驗

A：行為箱；B：行為箱俯視觀測圖(中間藍(lán)色圓圈是人為劃定的中央?yún)^(qū)，紅色曲線為小鼠運(yùn)動軌跡)。

1.11 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮實驗(the elevated plus maze test)：小鼠具有恐高的天性，對高處天然趨避，但對新環(huán)境又有探索的好奇心。1958年Montgomery等發(fā)現(xiàn)暴露在高架的迷宮通道中所引發(fā)的這種探究–趨避沖突，比暴露在封閉的曠場中所引發(fā)的焦慮沖突要強(qiáng)烈得多，基于此設(shè)計出開放和封閉區(qū)域不均一的高架Y-迷宮實驗；1985年P(guān)ellow等[28]利用等長的開放和封閉臂優(yōu)化成高架十字迷宮檢測小鼠的焦慮行為。

整個高架十字迷宮由兩條等長的臂(35 cm× 5 cm)十字交叉組成，其中一條臂的四周有不透明的擋板圍住，稱為閉臂(35 cm×5 cm×15 cm)；另一條周圍無擋板的臂稱為開臂；兩臂交叉的無擋板部分稱為中央?yún)^(qū)(5 cm×5 cm)。整個迷宮離地約60 cm，給小鼠營造一個恐懼的環(huán)境。

實驗前預(yù)處理和實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同。實驗時將小鼠背朝實驗者，面向開臂放在高架十字迷宮(圖7)的中央?yún)^(qū)，用攝像頭記錄小鼠5 min內(nèi)的行為數(shù)據(jù)，然后將小鼠取回放入飼養(yǎng)籠，更換實驗小鼠，面向同一開臂放入迷宮。每次試驗之間，用70%的乙醇清洗迷宮，若小鼠在迷宮中長時間無運(yùn)動或從迷宮墜落，則不計入最后的分析。

1.12 明暗穿梭實驗

明暗穿梭實驗(light/dark transition test)：基于小鼠對明亮照明區(qū)域的自然厭惡，以及對新環(huán)境的自發(fā)探索行為，2006年Takao[29]等利用人為控制的明暗環(huán)境優(yōu)化設(shè)計出明暗穿梭實驗，用于檢測小鼠的類焦慮行為。

明暗行為箱(27cm×27 cm×45 cm)由大小相同的明箱和暗箱組成，箱體頂部加蓋，內(nèi)部固定有高清攝像機(jī)記錄小鼠活動數(shù)據(jù)，明箱內(nèi)有亮光照明，兩箱之間的隔墻有一個可控制的門洞(7.5 cm×7.5 cm)供小鼠穿梭。

實驗前預(yù)處理和實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同。實驗時首先打開明暗箱內(nèi)的發(fā)光二極管，明箱中由白色二極管(390 Lux)明亮地照亮，而暗箱中則是黑色二極管(2 Lux)照射；將小鼠置于暗箱中，當(dāng)紅外攝像頭檢測到小鼠3 s后控制開門(防止小鼠在釋放后立即進(jìn)入光室，并有逃離實驗的動機(jī))；記錄10 min內(nèi)小鼠的活動情況，并在下一組實驗前用70%的乙醇清洗行為箱。

1.13 新事物識別實驗

新事物識別實驗(novel-object recognition test)：1988年由Enaceur和Delacour等[30]引入，目的是評估大鼠在熟悉環(huán)境中識別新物體的能力。從那時起，這項測試就開始流行起來，用于測試嚙齒類動物的認(rèn)知記憶。小鼠先天對新物體有探索傾向并通過對新物體(形狀、大小等)的靈活變換可檢測小鼠短期記憶和認(rèn)知能力。

圖7 高架十字迷宮實驗

新事物識別行為箱為上方敞口、四周透明的40 cm×40 cm×40 cm正方體，也可用曠場行為箱替代。實驗前五天，每天撫摸實驗小鼠1 min，避免刺激小鼠，使其消除與測試者的陌生感，實驗前兩天將小鼠放入行為房熟悉環(huán)境。實驗環(huán)境與三廂社交實驗相同，實驗分為3個階段：(1)將小鼠放入行為箱自由活動5 min，然后將小鼠移出行為箱并在行為箱側(cè)壁7 cm左右的位置水平放置兩個形狀、大小以及顏色均相同的物體(直徑約3 cm)；(2)將小鼠背對物體重新放入行為箱中央后打開攝像頭記錄其10 min內(nèi)小鼠的活動(圖 8A)；(3)將小鼠放回飼養(yǎng)籠，并將行為箱內(nèi)一個物體隨機(jī)替換為另一個大小相似但形狀和顏色不同的新物體，1 h后將小鼠重新背對物品放入行為箱記錄10 min的活動(圖 8B)。

1.14 水迷宮實驗

水迷宮實驗(Morris water maze test)：小鼠天生厭水，在水中會選擇最佳的路線逃離水環(huán)境。根據(jù)此特性1981年Morris通過強(qiáng)迫實驗動物游泳設(shè)計出水迷宮實驗，并迅速成為評估空間記憶和空間導(dǎo)航的標(biāo)準(zhǔn)任務(wù)。通過觀測小鼠在逃亡過程中是否能利用周圍環(huán)境進(jìn)行定位尋找隱藏在水中的逃生平臺來檢驗小鼠的空間參考記憶能力。小鼠搜尋并登上平臺所用的時間越短，小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力也就越強(qiáng)[31]。

圖8 新事物識別實驗

A：事物認(rèn)知；B：新事物識別。

水迷宮行為箱整體為直徑110 cm、高95 cm敞口的圓柱體，通過在地上劃線將箱內(nèi)人為等分為4個區(qū)域(Q1~Q4)，并在Q2內(nèi)通過支架固定一個直徑約8 cm的逃生平臺，每個區(qū)域箱壁等高的位置固定1個形狀不同的標(biāo)記物(高逃生平臺約20 cm，如三角形、圓形、正方形和五角星等)，作為逃生平臺的空間參考，并在正下方設(shè)置人為的入水口，將小鼠放入行為箱中。

小鼠放在行為房中飼養(yǎng)兩天，使其熟悉實驗環(huán)境。實驗前先灌水入迷宮中，直到其剛淹沒逃生平臺為止，同時保持室溫和水溫在24℃左右，并根據(jù)小鼠體色選擇高對比度的試劑將水變渾濁(如棕色或黑色鼠可用牛奶)，一方面阻擋小鼠的視線，隱藏水下的逃生平臺，另一方面確保SuperMaze系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確捕捉到小鼠的蹤跡(圖9A)。整個實驗為3個階段：(1)記憶獲取。將小鼠以半隨機(jī)方式選擇入水口，背對實驗人員面朝池壁放入迷宮中，記錄小鼠60 s內(nèi)在迷宮內(nèi)的運(yùn)動情況。若小鼠在60 s內(nèi)搜尋并登上平臺，讓其在平臺停留30 s以便根據(jù)4個入水口上的固定參照物對平臺位置進(jìn)行空間學(xué)習(xí)和記憶(圖9B)，并判定小鼠逃亡成功；若小鼠在60 s內(nèi)不能搜尋并登上平臺，則用手將其引導(dǎo)至平臺并停留30 s也讓其對平臺位置進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶，同時判定該小鼠逃亡成功。每天每只小鼠實驗4次，每次間隔15~25 min，確保每只實驗小鼠分別從4個入水口放入，防止小鼠采用非記憶性的策略進(jìn)行逃生；實驗連續(xù)進(jìn)行7 d，每天實驗起始時間應(yīng)相同，確保小鼠對平臺位置的記憶獲取。在每次水迷宮實驗結(jié)束后，實驗者應(yīng)注意立即用毛巾或者吹風(fēng)機(jī)將小鼠毛發(fā)晾干，避免小鼠因為著涼而影響接下來的實驗；(2)記憶鞏固。7 d的訓(xùn)練結(jié)束后將小鼠放回鼠籠，進(jìn)行24 h的記憶鞏固；(3)記憶提取。24 h后去除迷宮內(nèi)的逃生平臺，在原逃生平臺的對側(cè)象限入水口放入小鼠,記錄60 s內(nèi)小鼠運(yùn)動狀況，檢測小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。

圖9 水迷宮實驗

A：水迷宮裝置正視圖；B：水迷宮俯視圖(棕色標(biāo)注出隱藏在水面下的逃生平臺，紅色為小鼠運(yùn)動軌跡)。

2 實驗數(shù)據(jù)分析

2.1 ASD小鼠社交行為分析

社交障礙是孤獨(dú)癥譜系障礙核心缺陷之一，患者在社會認(rèn)知、社交互動、眼神接觸、理解和使用非言語溝通等方面存在困難[32]。研究中通常利用三廂社交實驗、居住者–侵入者實驗、筑巢實驗和超聲波發(fā)聲檢測這幾種方法來對小鼠模型進(jìn)行社交行為評估。

在三廂社交實驗中，通過攝像頭實時跟蹤、記錄小鼠的行為軌跡，用SuperMaze分析軟件統(tǒng)計小鼠的社交信息。(1)社交能力檢測：統(tǒng)計小鼠在empty室所待的總時間TE(鼠身進(jìn)入一半即開始計時，離開即停止計時)，以及和stranger1的接觸總時間TS(小鼠嗅探實驗鼠即開始計時，離開即停止計時)； (2)社交新穎性檢測：統(tǒng)計小鼠和stranger1以及 stranger2的接觸總時間TS1和TS2(計算方法如(1)中所示)。若TE≥TS表明有嚴(yán)重的社交能力缺陷；若TS1≥TS2則表明有嚴(yán)重的社交新奇性缺陷。孤獨(dú)癥小鼠模型通常社交新穎性能力明顯缺失，并伴隨有一定程度的社交能力障礙。在Fmr1ASD小鼠模型中，Naviaux等[33]發(fā)現(xiàn)Fmr1小鼠接觸時間TE≈TS、TS2

在居住者–入侵者實驗中，用攝像頭記錄4 d內(nèi)待測小鼠和侵入者之間的攻擊性(aggressivity be-haviors)[34]和非攻擊性行為(non-aggressive behaviors)的社交行為時間。非攻擊性的行為包括追逐、尾隨、前肢搭趴、捋毛、鼻–鼻互觸或鼻–下體接觸等[35]，而攻擊性行為包括受試小鼠主動撕咬/抓/怒視入侵小鼠等(圖2B)。非攻擊性行為(NS)減少或者攻擊性行為(NA)增加，表明受試小鼠存在社交缺陷。在NL3ASD小鼠模型中，Burrows等[36]發(fā)現(xiàn)NL3小鼠攻擊性行為增加2倍，非攻擊性社交行為無明顯差異，檢測出明顯的社交缺陷。

在筑巢實驗中，根據(jù)巢穴評分系統(tǒng)(nesting score system, NSS)[37](圖10)對巢穴進(jìn)行評分(S)，評分系統(tǒng)粗分為5大類：(1) 0分，小鼠未擾亂或使用筑巢材料；(2) 1分，小鼠擾亂材料但未將其聚集成巢位，材料只是簡單堆積；(3) 2分，小鼠聚集材料形成平坦巢穴，巢體外觀呈淺碟狀，巢壁不完全或缺；(4) 3分，材料被聚集形成杯狀巢穴，巢壁為可辨識的杯狀或碗狀：(5) 4分，材料被聚集形成不完全的圓頂巢穴，巢壁匯合超過半球體；(6) 5分，材料被聚集形成完整的圓頂巢穴，巢體四周或頂部只存在一個可容納一只小鼠進(jìn)出的進(jìn)出口。評分越低小鼠的社交行為缺陷越嚴(yán)重。在ASD小鼠模型中，Orefice等[9]發(fā)現(xiàn)小鼠筑巢得分顯著減少，檢測出明顯的社交缺陷。

圖10 小鼠筑巢評分圖

母子隔離誘導(dǎo)USVs實驗中，可以直接根據(jù)SONOTRACK系統(tǒng)統(tǒng)計出生后2、4、6、8和12天時的如下數(shù)據(jù)：(1)幼崽在5 min內(nèi)發(fā)出叫聲的總數(shù)目(NU)；(2)幼崽在5 min內(nèi)發(fā)出叫聲的總持續(xù)時間(TU)；(3)根據(jù)Chabout等[38]在2012年將小鼠USVs劃分成10種類型：短音(≤50 ms且≤10 kHz)、平音(≥50 ms且≤10 kHz)、單次跳頻音(瞬時的一個頻率改變)、多次跳頻音(多次的頻率改變)、U型音(U型波且≥10 kHz)、V型音(倒U型波且≥10 kHz)、調(diào)制音(幾個頻率的降低或增加且≥10 kHz)、復(fù)合音(同時釋放或多個頻率且≥10 kHz)、上行音(頻率逐漸上升且≥10 kHz)和下行音(頻率逐漸下降且≥10 kHz)，統(tǒng)計幼崽在5 min內(nèi)發(fā)音的復(fù)雜度(Cu)，每種發(fā)聲類型的總數(shù)目(NTU)和總持續(xù)時間(TTU)。NU和TU降低，則表明幼崽存在溝通障礙，有明顯的社交缺陷；Cu降低、NTU和TTU與正常幼崽相比有明顯的異常表達(dá)模式，也表明幼崽存在著社交缺陷。

成年小鼠求偶誘導(dǎo)USVs實驗中，同樣根據(jù)系統(tǒng)直接統(tǒng)計：(1)雄鼠在5 min內(nèi)發(fā)出叫聲的總數(shù)目(NU1)；(2)雄鼠在5 min內(nèi)發(fā)出叫聲的總持續(xù)時間(TU1)。NU1和TU1降低，則表明雄鼠存在社交缺陷。在Cntnap2ASD小鼠模型中，Brunner等[39]和Penagarikano等[40]發(fā)現(xiàn)Cntnap2幼崽和成年雄鼠USVs數(shù)目下降約1倍，檢測出明顯的社交缺陷。

2.2 ASD小鼠重復(fù)刻板行為分析

重復(fù)刻板行為是孤獨(dú)癥譜系障礙的核心缺陷之一，具體表現(xiàn)為刻板行為、強(qiáng)迫行為、自傷行為、儀式化行為、同一性行為和狹窄興趣[41]。在小鼠模型中通常用Y-迷宮自發(fā)選擇、捋毛實驗、刻板行為分析和彈珠埋藏這幾種方法來模擬重復(fù)刻板行為[35]。

在Y-迷宮自發(fā)選擇實驗中，根據(jù)小鼠進(jìn)入相同目標(biāo)臂的次數(shù)比例來表征重復(fù)刻板行為的程度。記錄小鼠在試驗總次數(shù)(NT)中進(jìn)入目標(biāo)臂的次數(shù)(NA)比例R (R= NA/NT)，R值越高，表示小鼠的重復(fù)刻板行為越嚴(yán)重。在RIM32ASD小鼠模型中，Zhu等[35]發(fā)現(xiàn)RIM32小鼠R值約為WT鼠的1.3倍，檢測出明顯的刻板重復(fù)行為。

在捋毛實驗中，用攝像頭記錄30 min內(nèi)小鼠的行為，人為統(tǒng)計小鼠梳理毛發(fā)所用的時間(TG)占總時間的比例，比例越高則刻板重復(fù)行為越嚴(yán)重。在ASD小鼠模型中，Pe?a等[42]發(fā)現(xiàn)小鼠捋毛時間約為WT鼠的1.7倍，檢測出明顯的刻板重復(fù)行為。

在刻板行為分析實驗中，用攝像頭記錄30 min內(nèi)小鼠的行為，統(tǒng)計所觀察到的各項刻板動作的次數(shù)、時間及其總次數(shù)(Nc)和時間(Tc)作為評估刻板運(yùn)動的指標(biāo)，統(tǒng)計的次數(shù)越多時間越長則表明重復(fù)刻板行為越嚴(yán)重。在C58/J ASD小鼠模型中，Moy等[43]發(fā)現(xiàn)C58/J小鼠相較于正常品系小鼠旋轉(zhuǎn)、空翻和垂直跳躍增加約4倍，后肢站立增加約2倍，檢測出明顯的刻板行為。

在彈珠埋藏實驗中，人為統(tǒng)計30 min內(nèi)小鼠埋藏彈珠的數(shù)目(埋藏深度為70%及以上，Nb)和小鼠挖掘墊料的時間(Td)，埋藏數(shù)目和挖掘時間增加則刻板重復(fù)行為越嚴(yán)重。在ASD小鼠模型中，Gkogkas等[44]發(fā)現(xiàn)小鼠埋藏彈珠的數(shù)目約為WT的2倍，檢測出明顯的刻板重復(fù)行為。

2.3 ASD小鼠焦慮行為分析

焦慮是一種心理生物學(xué)的情緒狀態(tài)或反應(yīng)，包括不愉快的緊張感、擔(dān)憂和神經(jīng)系統(tǒng)的自主激活，是ASD患者中常見的表型。小鼠模型中主要通過將動物暴露于自然的、潛在的致焦慮性情況來引起相應(yīng)行為反應(yīng)來檢測其焦慮水平[45]，有曠場實驗、高架十字迷宮實驗和明暗穿梭實驗等。

在曠場實驗中，利用SuperMaze系統(tǒng)統(tǒng)計和分析不同的觀察指標(biāo)：(1)優(yōu)先統(tǒng)計在行為箱中小鼠10 min (T)內(nèi)活動的總路程(Dt)，根據(jù)時間計算小鼠的平均速度V (V=Dt/T)。檢測小鼠的自發(fā)運(yùn)動能力[46]，避免運(yùn)動能力的缺陷影響實驗結(jié)果；(2)在電腦的SuperMaze軟件上根據(jù)人為劃分的中央?yún)^(qū)(中央直徑約32 cm的圓)和周邊區(qū)(圓外區(qū)域) (圖6B)，統(tǒng)計小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動的距離(Dc)以及在中央?yún)^(qū)所待的時間(Tc)，計算出小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動的距離占總距離的比例Rd (Rd=Dc/Dt)或者在中央?yún)^(qū)運(yùn)動時間占總時間的比例Rt (Rt=Tc/T)，比較小鼠Rd或者Rt，數(shù)值越小的小鼠焦慮程度越高。

在高架十字迷宮實驗中，同樣通過SuperMaze系統(tǒng)統(tǒng)計和分析不同的觀察指標(biāo)：(1)小鼠的平均速度。判斷小鼠的自發(fā)運(yùn)動能力；(2)計算出小鼠在開臂運(yùn)動時間(TO)占總時間(T)的比例Rto(Rto=TO/T)；(3)小鼠在開臂中運(yùn)動的總距離(DO)，計算出小鼠在開臂運(yùn)動的距離占總距離的比例(Rdo= DO/Dt)。Rto、Rdo越小，小鼠的焦慮程度越高[47]。在Arid1bASD小鼠模型中，Jung等[48]發(fā)現(xiàn)Arid1b小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動的時間和距離相比WT鼠減少了約3倍，在開臂運(yùn)動的時間相比WT鼠減少了約4倍，檢測出明顯的焦慮。

在明暗穿梭實驗中，利用記錄的數(shù)據(jù)統(tǒng)計10 min內(nèi)小鼠箱室的轉(zhuǎn)換次數(shù)(Nl)和在明箱中所待的總時間(Tl)，Nl和Tl降低，則表明小鼠焦慮程度較高。在Cadm1ASD小鼠模型中，Takayanagi等[49]發(fā)現(xiàn)Cadm1小鼠在明箱中呆的時間相較于WT降低了約8倍，表現(xiàn)出明顯的焦慮。

2.4 ASD小鼠學(xué)習(xí)記憶行為分析

學(xué)習(xí)和記憶障礙也是孤獨(dú)癥患者常見的缺陷之一，其具體表現(xiàn)為大多數(shù)患者學(xué)習(xí)能力較差，記憶能力比如復(fù)雜的視覺和語言信息記憶、空間參考記憶、聯(lián)想學(xué)習(xí)能力、語言工作記憶和識別記憶存在嚴(yán)重問題[50]。在小鼠模型中較為常見的是用新事物識別實驗和水迷宮實驗來檢測認(rèn)知記憶和參考記憶。

在新事物識別實驗中，根據(jù)錄像統(tǒng)計小鼠在步驟(3)中10 min內(nèi)探索新事物的時間(TN)和熟悉事物的時間(TF)，探索時間包括鼻子或嘴接觸物體和小鼠距離物體2~3 cm范圍內(nèi)探究的時間(前爪搭在物體上、鼻子嗅物體、舔物體等均屬探究物體，擺個架勢或爬到物體上不動不能算是對物體的探究)。若TN與TF相比無明顯差異，即小鼠無法區(qū)分新舊事物，則意味著小鼠的記憶存在障礙。在Arid1bASD小鼠模型中，Jung等[48]發(fā)現(xiàn)Arid1b小鼠探索新事物的時間TN與TF相比無明顯差異，檢測出明顯的記憶能力缺失。

在水迷宮實驗中，通過SuperMaze軟件在記憶獲取階段統(tǒng)計：(1)根據(jù)小鼠的運(yùn)動距離和時間統(tǒng)計出小鼠的自發(fā)運(yùn)動能力，首先排除小鼠自發(fā)運(yùn)動能力對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響；(2)記錄小鼠從入水到登上逃生平臺所用時間作為潛伏期(TL)。若小鼠60 s內(nèi)無法自己登上逃生平臺，則潛伏期記作60 s。潛伏期越長表明受試小鼠的記憶獲取能力越差。記憶提取階段需用SuperMaze軟件捕捉并記錄小鼠的運(yùn)動軌跡和統(tǒng)計小鼠經(jīng)過原隱藏平臺位置的次數(shù)。運(yùn)動軌跡雜亂無章，路過平臺次數(shù)(NT)顯著降低表明受試小鼠記憶提取能力越差，表明小鼠空間參考記憶有嚴(yán)重缺陷。

在Arid1bASD小鼠模型中，Jung等[48]發(fā)現(xiàn)Arid1b小鼠探索新事物的時間TN與TF相比無明顯差異；潛伏期時間明顯增加，約是WT鼠的3~4倍且記憶提取時路過平臺次數(shù)顯著減少，檢測出明顯的學(xué)習(xí)和記憶能力障礙[48]。

因為小鼠膽小怕驚，對環(huán)境變化敏感，為了確保行為學(xué)實驗結(jié)果的可靠性，需要遵循一些嚴(yán)格的要求：(1)溫度穩(wěn)定在22℃~25℃之間，噪音低于30 dB；(2)實驗組數(shù)量與對照組相似不低于10只，若是單只小鼠的重復(fù)實驗分析則不低于10次； (3)實驗均采用雄鼠，避免雌鼠發(fā)情期和體內(nèi)激素的干擾；(4)多采用2~6個月小鼠，年齡過大或過小的小鼠運(yùn)動能力有所缺陷，并有證據(jù)證明小鼠的焦慮會隨年齡的升高而增加[51]；(5)小鼠在暗階段最為活躍且內(nèi)源性激素差異不大，所以行為學(xué)分析實驗應(yīng)該遵循小鼠的光周期；(6)實驗前兩天將小鼠放置實驗地點熟悉環(huán)境，實驗前對小鼠的處理應(yīng)保持一致；(7)長期的社會隔離會導(dǎo)致小鼠的社交行為、學(xué)習(xí)記憶能力和焦慮的改變[52]，小鼠飼養(yǎng)保持每籠4~5只；(8)凡是涉及到人工統(tǒng)計數(shù)需雙盲。

雖然小鼠模型經(jīng)濟(jì)成本、時間成本、技術(shù)條件、同源性和行為學(xué)觀察總體評估最優(yōu)，是國內(nèi)外研究ASD致病機(jī)理最普遍的動物模型，但還有很多需要完善和解決的問題。一方面是嚙齒類動物和人類在社會行為和大腦解剖方面有明顯的進(jìn)化差異，這些行為和解剖學(xué)差異已經(jīng)成為關(guān)于嚙齒動物模型在研究孤獨(dú)癥方面的爭論問題[53]。另外，ASD患者已經(jīng)被證實患有大量的并發(fā)癥，比如睡眠、感知覺異常和肌肉張力問題等。在行為學(xué)實驗中，我們也可以利用睡眠剝奪[54]、刺激獎賞[55]、步態(tài)檢測和絲網(wǎng)測試[56,57]來檢測實驗小鼠是否存在ASD相關(guān)的并發(fā)癥。

3 應(yīng)用

3.1 孤獨(dú)癥譜系障礙基因工程小鼠模型行為學(xué)表型總結(jié)

小鼠的行為學(xué)方法廣泛應(yīng)用于各種孤獨(dú)癥譜系障礙基因工程小鼠模型中，不同的小鼠模型在社交缺陷、重復(fù)刻板、焦慮以及學(xué)習(xí)和記憶障礙等行為上具有相似的表型，但也存在明顯的差異。表1~ 表3分別總結(jié)了已有孤獨(dú)癥基因工程小鼠模型在社交和重復(fù)刻板行為以及焦慮和學(xué)習(xí)記憶行為測試中的表型，這些行為差異可能與其遺傳病理相關(guān)。

表1 ASD小鼠模型社交行為檢測

TE、TS表示小鼠在空室、含同類小鼠的室所待的時間；TS1、TS2表示小鼠與熟悉小鼠、陌生小鼠所待的時間；NA、NS表示小鼠攻擊性行為、非攻擊性社交行為的次數(shù)；S表示小鼠筑巢得分?jǐn)?shù)；NU、TU表示單位時間內(nèi)母子分離后幼崽發(fā)出的超聲波數(shù)目和持續(xù)時間；Cu表示幼崽超聲波發(fā)聲的種類；NU1表示成年小鼠求偶發(fā)出的超聲波數(shù)目；↑表示數(shù)目增加；↓表示數(shù)目減少。

表2 ASD小鼠重復(fù)刻板行為檢測

TG表示小鼠的捋毛時間；R表示小鼠未發(fā)生選擇改變的比例；Nc表示小鼠的刻板行為的次數(shù)統(tǒng)計；↑表示數(shù)目增加；↓表示數(shù)目減少；Nb表示小鼠單位時間內(nèi)埋藏彈珠的數(shù)目。

表3 ASD小鼠焦慮、學(xué)習(xí)記憶行為檢測

續(xù)表

Rt表示小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動的時間占總時間的比例；Rto表示小鼠在開臂運(yùn)動的時間占總時間的比例；Nl、Tl表示小鼠進(jìn)入明箱的次數(shù)、時間；TN、TF表示小鼠對新事物、舊事物探索的時間；TL、NT表示小鼠潛伏期時間、記憶提取時路過目標(biāo)平臺附近的次數(shù)。

3.2 孤獨(dú)癥譜系障礙小鼠行為學(xué)檢測方法應(yīng)用前景

近些年行為學(xué)檢測方法在不斷成熟與完善，實驗趨向低損傷、操作更加簡單、統(tǒng)計更快捷以及得到的實驗數(shù)據(jù)更加可靠。同時行為學(xué)實驗分析系統(tǒng)也不斷得到改進(jìn)，例如Noldus的EthoVision分析軟件，通過接收視頻信號，對每一幀進(jìn)行數(shù)字化，并分析生成的像素來確定被跟蹤動物的位置(以及其他數(shù)據(jù))。在行為學(xué)實驗中可以獲得動物在特定區(qū)域的運(yùn)動路程、運(yùn)動軌跡、站立次數(shù)、時間、速度和進(jìn)入該區(qū)域的頻次等，使得行為學(xué)的實驗統(tǒng)計結(jié)果包含更多信息[102]。

行為學(xué)方法的引入為實驗室研究ASD的致病機(jī)理提供了多元化方向：(1)根據(jù)已經(jīng)報導(dǎo)的ASD相關(guān)基因，結(jié)合基因工程的技術(shù)在動物模型上進(jìn)行基因的編輯，根據(jù)行為學(xué)實驗結(jié)果，判斷是否有ASD樣行為，然后對該基因的上下游進(jìn)行分析，尋找完整的分子環(huán)路。(2)利用反義核酸等技術(shù)，在一定時間內(nèi)臨時阻斷某個特定基因的表達(dá)并根據(jù)行為學(xué)的實驗數(shù)據(jù)，快速并直觀的篩選出與ASD相關(guān)的基因，并可與相應(yīng)的遺傳工程動物模型進(jìn)行比較，同時也促進(jìn)了動物學(xué)、分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)的交叉和結(jié)合[103]。(3)以膜片鉗技術(shù)與動物行為學(xué)實驗相結(jié)合，通過在特定腦區(qū)注射相應(yīng)的病毒，人為控制特定基因的表達(dá)，并根據(jù)行為學(xué)實驗結(jié)果，采用離體腦片的膜片鉗記錄電位的傳遞并通過免疫染色技術(shù)構(gòu)建出相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)和類型，在分子、細(xì)胞和神經(jīng)環(huán)路的水平上闡述ASD的致病機(jī)理。

行為學(xué)方法的引入也極大促進(jìn)了ASD臨床治療的研究，ASD動物模型產(chǎn)生的行為學(xué)數(shù)據(jù)是神經(jīng)精神藥物開發(fā)的基石，采用動物行為學(xué)進(jìn)行ASD藥物的研發(fā)與檢測具有更全面、可靠和準(zhǔn)確的特點，在國際科學(xué)界受到廣泛應(yīng)用。熟練的掌握這這些行為學(xué)檢測方法，有助于闡釋ASD致病機(jī)理和尋找治療方法的研究。

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Behavioral analyses in mouse models of autism spectrum disorders

Jianfei Wang, Junhai Han, Zichao Zhang

Autism spectrum disorder is a group of genetically-related developmental disorders of the nervous system. Patients mainly present with core symptoms such as social behavior defects, repetitive stereotyped behaviors, and learning and memory disorders. The mouse models are critical for the studies of the pathogenic mechanisms and potential therapeutic strategies of autism spectrum disorder. The assessments of mouse behaviors provide understandings of the effects of different genetic manipulations as well as pathogenic mechanisms of these diseases. This article describes various mouse behavioral assays corresponding to the core symptoms of ASD patients and provides a detailed description of protocols, cautions, and data analysis for those assays, thereby helping researchers to establish their own experimental designs. In addition, behavioral phenotypes of currently known ASD mouse models are summarized to provide a reference for researchers in the field.

autism spectrum disorder; mouse behavioral analysis; social disorder; repetitive behavior; learning and memory; anxiety

2020-11-18;

2021-02-08

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31871374，81730034)和江蘇省自然科學(xué)基金項目(編號：BK20170080)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31871374, 81730034), and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20170080)]

王劍飛，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：孤獨(dú)癥致病機(jī)制。E-mail: w13912971049@163.com

張子超，博士，副研究員，研究方向：分子神經(jīng)生物學(xué)。E-mail: zhangzc@seu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-391

2021/3/22 15:20:40

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210319.1153.002.html

(責(zé)任編委: 許琪)