何家樂(lè)，吳幻，劉夢(mèng)綺，李勁，姜博文，吳昊，楊洪巖

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

酸菜是我國(guó)東北地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜，傳統(tǒng)腌制方法是將新鮮白菜洗凈后，浸入裝有鹽水的陶缸中，碼至頂端后用腌菜石壓實(shí),經(jīng)過(guò)30 d左右的自然發(fā)酵即可食用。隨著生活節(jié)奏的加快，酸菜傳統(tǒng)的小家小戶制作已經(jīng)逐漸向規(guī)模化、商業(yè)化過(guò)渡。目前的商業(yè)化酸菜生產(chǎn)仍然主要依靠自然發(fā)酵，普遍存在發(fā)酵周期長(zhǎng)和質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題[1]。

微生物是引起蔬菜發(fā)酵體系一系列物理化學(xué)變化的主要因素[2]，控制發(fā)酵體系的微生物才能從根本上控制發(fā)酵周期和發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量。在我們之前的研究中，已經(jīng)對(duì)酸菜發(fā)酵體系中的微生物進(jìn)行了系統(tǒng)解析，結(jié)果顯示：在酸菜發(fā)酵體系中包含Acinetobactersp.，Pseudomonasfragi,Klebsiellasp.,Citrobactersp.,Betaproteobacteriasp.和乳酸菌等微生物種屬，Leuconostocmesenteroides,Lactobacilluscurvatus,L.plantarum和L.oligofermentans是發(fā)酵中的主體微生物[3]。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)接種Lactobacillus在發(fā)酵體系內(nèi)占據(jù)主導(dǎo)，顯著加速發(fā)酵進(jìn)程和提高發(fā)酵質(zhì)量[4-5]。

碳水化合物是所有活生物體中細(xì)胞碳和能量的主要來(lái)源。乳酸菌是酸菜發(fā)酵中的主要微生物[6]，可以利用各種可溶性碳水化合物作為底物生產(chǎn)有機(jī)酸。因此，添加碳水化合物有利于乳酸菌的生長(zhǎng)。在制作酸菜時(shí)，當(dāng)乳酸菌接種劑不易獲得時(shí)，經(jīng)驗(yàn)上會(huì)向發(fā)酵體系內(nèi)添加糖，以營(yíng)造利于酸菜本源乳酸菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而加速發(fā)酵進(jìn)程，然而加糖對(duì)發(fā)酵體系理化及微生物產(chǎn)生的影響尚不明確。在本研究中，為了明確在酸菜發(fā)酵過(guò)程中添加糖對(duì)發(fā)酵體系的影響，設(shè)置不添加對(duì)照、添加蔗糖處理和添加乳酸菌3個(gè)處理，通過(guò)對(duì)發(fā)酵體系理化及微生物學(xué)特征的研究明確加糖對(duì)發(fā)酵體系的影響，為酸菜的規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 接種與發(fā)酵

白菜發(fā)酵參照參考文獻(xiàn)[5]所描述的方法。簡(jiǎn)要描述如下：收獲白菜，風(fēng)干萎蔫2 d，修剪、清洗后層層碼入250 L陶缸中，然后用腌菜石壓實(shí)，鹽與糖或菌劑隨水加入陶缸中，鹽的添加比例為總白菜重的1%(W/W)，糖的添加比例為總白菜重的0.5%(W/W)。對(duì)于乳酸菌接種處理，根據(jù)課題組前期的研究成果，選用Lactobacilluscurvatus與Lactobacillusoligofermentans混合接種劑處理。兩菌株在優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h(OD600=1.5)后，以5800×g離心3 min，除去上清液后，將細(xì)胞重懸于無(wú)菌蒸餾水中，并以3∶1的比例混合。接種率為1×106菌落形成單位(CFU)/g新鮮白菜。所有處理設(shè)3次重復(fù)，于18 ℃下發(fā)酵30 d，分別在發(fā)酵的第0，6，12，18，24，30天進(jìn)行采樣。

1.2 取樣

在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，從陶缸表面下第3層取出白菜，用榨汁機(jī)勻漿后取汁液約0.5 mL用于微生物菌落計(jì)數(shù)；取30 mL于4 ℃下5800×g離心10 min后，將所得沉淀重懸于2 mL提取緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl和40 mmol/L EDTA，pH 9.0)中。將每處理3個(gè)重復(fù)樣品合于一管，凍存于-20 ℃用于DNA提取及后續(xù)高通量測(cè)序分析。離心所得上清液(0.7 mL)加入0.3 mL乙腈(高效液相色譜(HPLC)級(jí)，Dikma，加利福尼亞州萊克福里斯特，美國(guó))，渦旋后，靜置10 min，隨后10800×g離心10 min，用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，上清液保存在-20 ℃，用于HPLC分析。取白菜由外向內(nèi)數(shù)第二層葉片，于105 ℃烘干粉碎過(guò)2 mm目篩，用于可溶性糖(WSC)的測(cè)定。

1.3 微生物計(jì)數(shù)與理化指標(biāo)分析

乳酸菌和一般細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)采用平板稀釋法。乳酸菌在MRS[7]瓊脂上30 ℃培養(yǎng)2 d，其他一般細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上在37 ℃培養(yǎng)2 d。使用pH計(jì)(B-212，Horiba，Kyoto，日本)進(jìn)行pH測(cè)量?？扇苄蕴遣捎幂焱壬╗8]。有機(jī)酸采用高效液相色譜(HPLC)法(Waters，Milford，MA，美國(guó))。使用高親和力陽(yáng)離子交換柱(Aminex HPX-87H，300 mm×7.8 mm，Bio-Rad，Hercules，CA，美國(guó))進(jìn)行色譜分離。柱溫為40 ℃，流速為0.6 mL/min，流動(dòng)相中的H2SO4濃度為5 mmol/L，所有樣品均運(yùn)行30 min。使用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平為p<0.05。

1.4 DNA提取和高通量測(cè)序

總DNA的提取采用試劑盒法(Omega,USA)。建庫(kù)引物選擇515F(5＇-GTGCCAGCMGCCGCGG-3＇)和907R(5＇-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3＇)[9]。利用雙末端測(cè)序(Paired-End)法構(gòu)建小片段測(cè)序文庫(kù)，質(zhì)檢合格后用MiSeq Illumina測(cè)序平臺(tái)測(cè)序(美吉生物有限公司，上海，中國(guó))。

1.5 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

使用QIIME處理和分析高通量測(cè)序數(shù)據(jù)?；赒IIME中的Uchime算法[10]，使用Usearch刪除嵌合序列。按97%的序列相似性進(jìn)行操作分類單元(OTU)劃分。使用QIIME軟件對(duì)樣本的Alpha多樣性指數(shù)(Ace，Chao 1，Shannon，Simpson和Coverage)進(jìn)行分析。此外，使用R軟件的Vegan包進(jìn)行了主成分分析。原始序列數(shù)據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為SRX1078336。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸菜發(fā)酵過(guò)程中的pH動(dòng)態(tài)

本研究設(shè)置3個(gè)處理，無(wú)添加對(duì)照、添加蔗糖處理和添加乳酸菌處理。3個(gè)處理的pH動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖1。在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，加糖和乳酸菌處理的pH值下降速度均快于對(duì)照(p<0.05)。從發(fā)酵的第6天起，加糖處理的pH低于對(duì)照的pH(p<0.05)，并且在整個(gè)發(fā)酵期間均顯著低于其他處理(p<0.05)。

圖1 酸菜發(fā)酵pH動(dòng)態(tài)Fig.1 The pH values' dynamic changes of sauerkraut during fermentation注：Control表示無(wú)添加對(duì)照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理；字母不同代表顯著性不同(p<0.05)。

2.2 酸菜發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)酸動(dòng)態(tài)

利用HPLC檢測(cè)到的乳酸、乙酸和丙酸動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖2。

圖2 酸菜發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)酸動(dòng)態(tài)Fig.2 The organic acids' dynamic changes of sauerkraut during fermentation注：Control表示無(wú)添加對(duì)照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理；字母不同代表顯著性不同(p<0.05)。A表示乳酸，B表示乙酸，C表示丙酸。

添加LAB處理乳酸水平最高。蔗糖添加處理中的乳酸水平高于對(duì)照，但低于乳酸菌接種處理(p<0.05)。在發(fā)酵的前12 d，對(duì)照中的乙酸水平最高，隨后是加糖處理(p<0.05)。乳酸菌接種處理中的乙酸水平在整個(gè)發(fā)酵期間最低。在本研究中還檢測(cè)到丙酸，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，丙酸的濃度增加。在第30天時(shí)，所有處理丙酸的濃度大于1.0 g/L。

2.3 酸菜發(fā)酵過(guò)程中的微生物菌落動(dòng)態(tài)

使用平板稀釋法進(jìn)行微生物菌落計(jì)數(shù)，見(jiàn)圖3。在發(fā)酵的前12 d，乳酸菌增加明顯(p<0.05)，此后各處理之間的乳酸菌變化不再顯著。在發(fā)酵的第6天，對(duì)照中的乳酸菌明顯少于其他處理(p<0.05)。在所有處理中，經(jīng)過(guò)18 d的發(fā)酵，一般細(xì)菌的數(shù)量均顯著減少(p<0.05)。直至第24天，所有處理的一般細(xì)菌數(shù)量沒(méi)有顯著差異。

圖3 酸菜發(fā)酵過(guò)程中的微生物菌落動(dòng)態(tài)Fig.3 The microbial colonies' dynamic changes of sauerkraut during fermentation注：Control表示無(wú)添加對(duì)照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理；字母不同代表顯著性不同(p<0.05)。A表示乳酸菌，B表示一般細(xì)菌。

2.4 酸菜發(fā)酵過(guò)程中的可溶性糖動(dòng)態(tài)

發(fā)酵體系對(duì)可溶性糖(WSC)的消耗見(jiàn)圖4。在發(fā)酵的第6～30 d，可溶性糖的水平顯著下降，最明顯的變化發(fā)生在前18 d。添加乳酸菌處理的WSC下降最快(p<0.05)。在第30天時(shí)，WSC的濃度約為3.0 g/100 g干物質(zhì)。

圖4 酸菜發(fā)酵過(guò)程中的可溶性糖動(dòng)態(tài)Fig.4 The soluble sugar's dynamic changes of sauerkraut during fermentation注：Control表示無(wú)添加對(duì)照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理；字母不同代表顯著性不同(p<0.05)。WSC表示可溶性糖，DM表示干物質(zhì)。

2.5 門(mén)、屬水平上的微生物群落組成

通過(guò)高通量測(cè)序分析，總共獲得了247850個(gè)有效序列，每個(gè)樣品的平均值為16523(標(biāo)準(zhǔn)差=4616)。物種豐富度Alpha多樣性指數(shù)見(jiàn)表1。每種處理的生物分類組成見(jiàn)圖5(A為門(mén)水平，B為屬水平)。

表1 酸菜樣品OTU豐富度、樣品覆蓋度和多樣性指數(shù)Table 1 The OTU richness, sample coverage rates and diversity indexes of sauerkraut samples

圖5 細(xì)菌門(mén)水平、屬水平的群落組成多樣性Fig.5 The community composition diversity at phylum level and genus level注：未鑒定出的序列統(tǒng)一標(biāo)記為No_Rank；Control表示無(wú)添加對(duì)照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理。

由圖5可知，在這3種處理中，檢測(cè)到的門(mén)包括Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes，Actinobacteria，Cyanobacteria，F(xiàn)usobacteria和Verrucomicrobia等。在所有處理中，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria占據(jù)優(yōu)勢(shì)。在乳酸菌接種處理中，厚壁菌門(mén)優(yōu)勢(shì)最為明顯。

在屬水平上，主要檢測(cè)到Lactobacillus，Lactococcus，Enterobacter，Pseudomonas，Leuconostoc，Enterobacteriaceae_unclassified，Acinetobacter和Arcobacter。在對(duì)照中，Lactobacillus，Lactococcus，Pseudomonas，Leuconostoc和Enterobacteriaceae是主要菌屬；在乳酸菌接種處理中，Lactobacillus占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在對(duì)照處理中，在發(fā)酵的第30天，Lactococcus的最高比例達(dá)到29.7%，在發(fā)酵的第18天，Lactobacillus的最高比例達(dá)到45.9%。在發(fā)酵的第12天，Leuconostoc的最高相對(duì)含量達(dá)4.6%。在乳酸菌接種處理中，在發(fā)酵的第12天，Lactobacillus的相對(duì)豐度達(dá)到66.4%，之后Lactobacillus的比例達(dá)到≥80%以上。

在糖添加處理中，Lactobacillus的相對(duì)豐度在發(fā)酵過(guò)程中不斷增加。在發(fā)酵的第30天，Lactobacillus的相對(duì)豐度從第6天的13.8%增加到54.7%。在發(fā)酵的前18 d，Lactococcus的比例持續(xù)增加，最大值達(dá)到22.9%，在發(fā)酵第30天比例下降到9.9%。在加糖處理中，Enterobacter比例比其他處理高，在發(fā)酵第6天的相對(duì)豐度為39.3%，在發(fā)酵第30天其相對(duì)豐度為14.1%。加糖處理中Leuconostoc的比例也是所有處理中最高的，其最大值為12.7%。

通過(guò)PCA分析，比較了3個(gè)處理中15個(gè)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖6。

圖6 酸菜樣品發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落主成分分析Fig.6 The principal component analysis of bacterial colonies of sauerkraut samples during fermentation注：Control表示無(wú)添加對(duì)照；Sucrose表示加糖處理；Community表示加乳酸菌處理。

由圖6可知，無(wú)添加處理和乳酸菌接種處理在PC1軸分開(kāi)，說(shuō)明接種微生物可以解釋兩處理菌落組成不同的54.08%；加糖處理與對(duì)照處理在PC2軸分開(kāi)，說(shuō)明加糖處理可以解釋兩處理微生物群落結(jié)構(gòu)差異的21.39%；除第6天樣品外，接種處理與加糖處理在PC2軸分開(kāi)，表明接種和加糖處理對(duì)于發(fā)酵后期微生物結(jié)構(gòu)的影響更為顯著。

3 討論

3.1 加糖酸菜發(fā)酵的理化動(dòng)態(tài)解析

由于地域和季節(jié)不同，世界各地生產(chǎn)的發(fā)酵蔬菜的種類也存在很大差異，但發(fā)酵作為蔬菜的保藏方式由來(lái)已久[11]。與其他類型的發(fā)酵食品一樣，發(fā)酵蔬菜內(nèi)含有各種微生物，乳酸菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中起著主導(dǎo)作用。它們代謝原材料的化學(xué)成分，以改善風(fēng)味和材料質(zhì)地并幫助提高消化率。此外，乳酸菌還可以產(chǎn)生抑菌化合物從而顯示益生特性[12]。我們以前的研究顯示，在傳統(tǒng)自然發(fā)酵過(guò)程中，pH值和可溶性糖含量的下降主要發(fā)生在發(fā)酵的前12 d，乳酸積累主要發(fā)生在前18 d，在第12天觀察到乙酸濃度的增加。在本研究中，對(duì)照的發(fā)酵是自發(fā)的，其發(fā)酵的理化變化與先前的研究一致。然而，與對(duì)照相比，其他兩種處理的理化變化更為劇烈。蔬菜發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生的物理化學(xué)變化是由微生物變化引起的[13]，所以不同處理理化變化不同的結(jié)果表明添加乳酸菌或蔗糖會(huì)顯著影響微生物的代謝能力及水平。

3.2 基于高通量測(cè)序的微生物多樣性分析

基于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)鑒定微生物多樣性存在很多局限，從樣品中直接提取核酸后進(jìn)行高通量測(cè)序已經(jīng)成為分析自然生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的重要工具[14]。在本研究中，通過(guò)高通量測(cè)序分析了酸菜中細(xì)菌群落的多樣性。在門(mén)的水平上，主要包括Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes，Actinobacteria，Cyanobacteria，F(xiàn)usobacteria和Verrucomicrobia等(見(jiàn)圖5)。通常在水果、蔬菜和發(fā)酵乳中檢測(cè)到Firmicutes，Proteobacteria，Bacteroidetes和Actinobacteria等[15-16]，而Cyanobacteria和Fusobacteria在海草、植物的根系中多有發(fā)現(xiàn)[17]，Verrucomicrobia在瘤胃中更為常見(jiàn)[18-19]，這些結(jié)果說(shuō)明酸菜發(fā)酵體系中微生物群落多樣性豐富。在屬水平上，檢測(cè)到了Lactobacillus，Lactococcus，Enterobacter，Pseudomonas，Leuconostoc，Enterobacteriaceae_unclassified，Acinetobacter和Arcobacter等，該結(jié)果與我們先前對(duì)自發(fā)酸菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌屬的研究一致。在較低水平檢測(cè)到的其他屬包括Weissella，Aeromonas，Comamonas，Saccharibacillus，Shewanella，Kluyvera，F(xiàn)lavobacterium，Chryseobacterium，Janthinbacterium，Aquabacterium和Rhodococcus。

3.3 接種微生物和加糖對(duì)酸菜發(fā)酵微生物動(dòng)態(tài)的影響

在蔬菜和水果的發(fā)酵過(guò)程中，控制乳酸發(fā)酵的方法主要有兩種：使用本源或異源發(fā)酵劑。從水果和蔬菜附著的本源微生物中選擇發(fā)酵菌種更值得推薦，因?yàn)楸驹淳谘娱L(zhǎng)保質(zhì)期、改善制品營(yíng)養(yǎng)和感官特性方面更具有優(yōu)勢(shì)[20]。本研究中所用的乳酸菌接種劑來(lái)源于酸菜本身。接種后，可以迅速在發(fā)酵體系內(nèi)定殖，使Lactobacillus成為最主要屬。

每個(gè)植物物種都有特定優(yōu)勢(shì)和恒定的微生物群[21]。乳酸菌是蔬菜原材料上的本源菌群的一小部分(2.0～4.0 log CFU/g)[22]。已從不同類型的蔬菜中鑒定到Leuconostoc，Lactobacillus，Weissella，Enterococcus和Pediococcus等異型發(fā)酵和同型發(fā)酵種。當(dāng)條件合適時(shí)，新鮮蔬菜可能會(huì)自發(fā)進(jìn)行乳酸發(fā)酵。對(duì)于酸菜發(fā)酵，主要的微生物是乳酸菌。乳酸發(fā)酵的底物是WSC，葡萄糖、果糖和蔗糖是其中的典型代表[23]。在本研究中，我們將蔗糖添加到發(fā)酵系統(tǒng)中以觀察其對(duì)微生物群落的影響。在添加蔗糖處理中，各種細(xì)菌屬的相對(duì)豐度與對(duì)照相比顯著不同。Lactobacillus的相對(duì)豐度在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)增加，在第30天約占細(xì)菌總數(shù)的54.7%。Lactococcus，Enterobacter，Leuconostoc特別是Enterobacter顯著增加，腸桿菌屬兼性厭氧菌，在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)即已啟動(dòng)。腸細(xì)菌種類的相對(duì)豐度在第6天最高(39.3%，見(jiàn)圖5)，但到第30天已開(kāi)始下降(相對(duì)豐度為14.1%)。已有研究表明，未加工的蔬菜中可能存在凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌和其他腸細(xì)菌，其細(xì)胞密度低，由于面臨微生物競(jìng)爭(zhēng)而使生長(zhǎng)受到抑制，在某些特殊情況下可能致病[24]。因此綜合本研究結(jié)果，加糖與添加乳酸菌兩種處理比較，接種乳酸菌可以更好地控制酸菜發(fā)酵，獲得相對(duì)更安全的酸菜產(chǎn)品。

4 結(jié)論

在本研究中，為了明確加糖對(duì)酸菜發(fā)酵效果的影響，將乳酸菌或蔗糖添加到發(fā)酵體系中，分析發(fā)酵體系的理化及微生物動(dòng)態(tài)。從理化指標(biāo)來(lái)看，添加乳酸菌或蔗糖可以更快地降低發(fā)酵系統(tǒng)的pH。接種乳酸菌處理乳酸的濃度更高。微生物分析表明，乳酸菌接種劑可以在發(fā)酵系統(tǒng)中棲息并占主導(dǎo)地位。蔗糖的添加一定程度上支持腸桿菌的生長(zhǎng)，加糖與加乳酸菌比較，接種乳酸菌更有利。本研究結(jié)果為東北酸菜生產(chǎn)的規(guī)模化、規(guī)范化提供了技術(shù)參考。