林善婷，胡 曉，李來好，楊賢慶，陳勝軍，吳燕燕，黃 卉，榮 輝

（1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點研究室，廣東 廣州 510300）

羅非魚（Oreochromis niloticus）因其具有生長快、病害少、肉質(zhì)鮮美、蛋白質(zhì)含量高等特點，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向世界各國推廣的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類之一。我國羅非魚資源豐富，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和出口量穩(wěn)居世界前列[1]。然而，羅非魚加工產(chǎn)品主要以凍全魚和冷凍魚片為主，產(chǎn)品結構單一，精深加工水平及高值化利用率不高，且羅非魚加工過程中會產(chǎn)生約60%～70%的富含蛋白質(zhì)的加工副產(chǎn)物，如魚皮、魚鱗、魚頭、魚骨、魚肉碎屑等，其加工副產(chǎn)物大多用作飼料、肥料或直接廢棄，其優(yōu)質(zhì)的蛋白資源未得到充分開發(fā)與利用[2]。

鐵元素是人體中血紅素及大多數(shù)酶類的構成成分，參與氧氣的運輸及機體細胞代謝，在維持人體正常造血功能以及增強神經(jīng)/免疫系統(tǒng)功能中起重要作用，當體內(nèi)缺乏鐵元素時易導致貧血、食欲不振、生長緩慢，尤其是孕期鐵元素缺乏的孕婦易導致胎兒早產(chǎn)，增加母嬰死亡風險等[3]。鐵元素缺乏是世界上最常見且普遍的營養(yǎng)缺乏癥，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)，幾乎一半的6～59 個月的兒童以及1/3的育齡婦女患有缺鐵性貧血癥[4]。

Fe2＋結合活性肽是指具有結合Fe2＋活性的肽類物質(zhì)，其與Fe2＋結合后形成的肽-Fe2＋結合物，在腸道中可提高并保持Fe2＋的溶解度，提高Fe2＋在腸道中的生物利用度[5]。目前，已有研究證明鷹嘴豆[6]、核桃[7]、綠豆[8]以及蛋清[9]、酪蛋白[10]、鱈魚皮[11-13]、鳀魚肌肉[14]等蛋白酶解物多肽具有Fe2＋結合活性，而對于羅非魚皮酶解物多肽（tilapia skin protein peptides，TSPP）的Fe2＋結合活性研究尚少。因此，本研究以羅非魚加工副產(chǎn)物之一的羅非魚皮為原料，制備Fe2＋結合活性肽及其肽-Fe2＋結合物，并探究其結合過程中結構和活性的變化，為進一步制備膳食鐵元素補充劑打下基礎，也可提高羅非魚加工副產(chǎn)物的高值化利用率，提高我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益以及在國際市場上的競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮 廣東百維生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、酪蛋白 合肥博美生物科技有限公司；菲啰嗪 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水硫酸亞鐵（FeSO4）、乙酸鈉（CH3COONa）、冰醋酸（CH3COOH）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、溴化鉀（KBr）（色譜級） 美國Sigma公司；ABTS總抗氧化能力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器公司；水浴恒溫振蕩器 金壇市精達儀器制造廠；自動電位滴定儀 瑞士萬通公司；SUNRISE吸光酶標儀 瑞士TECAN公司；熒光分光光度計 美國VARIAN公司；紫外-可見分光光度計、紅外光譜儀、高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 TSPP的制備

魚皮解凍洗凈，參照Zhang Yufeng等[15]的方法并稍作修改，按1∶10（g/mL）的比例加入0.05 mol/L的NaOH溶液，室溫下攪拌浸泡30 min后流水洗至中性，隨后按1∶10（g/mL）的比例加入0.05 mol/L的HCl溶液，室溫攪拌浸泡10 min后流水洗至中性，瀝干，魚皮打漿，漿液置于60 ℃恒溫水浴加熱5 h后，10 000 r/min離心20 min，取上清液，記下膠液的質(zhì)量，凱氏定氮法測定膠液中蛋白含量。

取一定質(zhì)量的羅非魚皮膠液，加入質(zhì)量分數(shù)2%（按膠液蛋白含量為基底）的蛋白酶，在其各自最優(yōu)的酶解條件（表1）下酶解1、2、4、6、8 h，期間保持pH值穩(wěn)定，酶解完成后沸水浴加熱15 min滅酶，冷卻后抽濾，10 000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥即為TSPP。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Optimal enzymatic conditions for the proteases tested in this study

1.3.2 水解度及Fe2＋結合率的測定

利用凱氏定氮法測定魚皮總氮質(zhì)量M1（g），自動電位滴定法測定酶解液中氨基態(tài)氮的質(zhì)量M2（g），水解度按式（1）計算：

Fe2＋結合率通過菲咯嗪比色法測得，參照Wu Haohao等[14]的方法并稍作修改，利用乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 5.0）配制5 mg/mL的樣品溶液，取700 μL樣品溶液與100 μL硫酸亞鐵溶液（0.2 mmol/L）混合于96 孔板中，37 ℃保溫2 h后，加入200 μL菲咯嗪溶液（5 mmol/L），室溫下放置10 min后，用酶標儀讀取562 nm波長處的吸光度，將酪蛋白的胰蛋白酶酶解物及谷胱甘肽作為陽性對照[14]，F(xiàn)e2＋結合率按式（2）計算：

式中：A0為加等體積水的吸光度；A1為加樣品后的吸光度。

1.3.3 TSPP與Fe2＋結合條件的優(yōu)化

以結合時間120 min、pH 5、溫度37 ℃為基礎結合條件，測定不同結合時間（15、30、60、90、120、150、180、210、240 min）、pH值（4、5、6、7）、溫度（4、25、37、60 ℃）對結合率的影響。

1.3.4 TSPP與Fe2＋結合過程中熒光光譜掃描

分別將在不同條件下完成結合反應的樣品溶液進行熒光光譜掃描，激發(fā)波長為275 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為290～500 nm，間距為0.2 nm。

1.3.5 TSPP與TSPP-Fe2＋結合物的紫外光譜掃描

分別將乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 5）、0.2 mol/L的FeSO4溶液（過濾前后）、5 mg/mL的TSPP溶液、TSPP＋FeSO4溶液（過濾前后）以及5 mg/mL的TSPP-Fe2＋結合物溶液進行紫外光譜掃描。

1.3.6 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物的紅外光譜掃描

分別將TSPP、TSPP-Fe2＋結合物與溴化鉀按1∶5的質(zhì)量比進行研磨壓片，進行紅外光譜掃描。

1.3.7 分子質(zhì)量分布的測定

采用高效體積排阻色譜法測定肽的分子質(zhì)量分布，參照Guo Lidong等[12]方法并略作修改，流動相為乙腈（含0.1%三氟乙酸）-水（含0.1%三氟乙酸）體積比20∶80，檢測波長為214 nm，進樣體積20 μL（2 mg/mL），流速0.5 mL/min。不同相對分子質(zhì)量標準樣品（細胞色素C，Mr12 400；桿菌肽，Mr6 511.44；抑肽酶，Mr1 422.69；氧化型谷胱甘肽，Mr612.63；還原型谷胱甘肽，Mr307.3）用流動相配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標準品混合液，0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣，將制備的混合標準品樣品在色譜條件下分析，以相對保留時間（t）為橫坐標，分子質(zhì)量對數(shù)（lgMr）為縱坐標制作標準曲線，相同的條件下檢測TSPP樣品，根據(jù)樣品的保留時間，對照標準曲線的結果，計算樣品的分子質(zhì)量分布。

1.3.8 氨基酸含量的測定

參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

1.3.9 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物抗氧化能力的測定

1.3.9.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照Lu Xin等[16]方法并略作修改，準確吸取1.00 mL的TSPP樣品溶液（5 mg/mL）與1.00 mL的DPPH-乙醇溶液（0.15 mmol/L，用95%的乙醇溶液溶解）混勻，在室溫下避光反應30 min，于517 nm波長處測定溶液吸光度As，空白組為1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液，加入1 mL樣液混合，在517 nm波長處測定吸光度Ab，對照組為1 mL的DPPH溶液加上1 mL 95%乙醇溶液，在517 nm波長處測定其吸光度Ac，以谷胱甘肽作陽性對照，DPPH自由基清除率按式（3）計算：

1.3.9.2 Trolox等效抗氧化能力的測定

參照試劑盒說明書測定樣品的Trolox等效抗氧化能力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結果用表示，結果間的差異性采用單因素方法分析（one-way ANOVA），隨后進行Tukey多重比較，P＜0.05，差異顯著；采用Origin 9軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 TSPP的Fe2＋結合活性

由圖1可知，在5 種蛋白酶作用下，羅非魚皮蛋白水解度均隨酶解時間的延長而逐漸增大。5 種蛋白酶對羅非魚皮蛋白水解度由小到大依次為胃蛋白酶＜胰蛋白酶＜堿性蛋白酶＜中性蛋白酶＜復合蛋白酶，其中復合蛋白酶8 h的水解度最高，為26.39%。由圖2可知，羅非魚皮蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解（1～8 h）得到的TSPP其Fe2＋結合率均高于其他4 種蛋白酶的酶解物，且胰蛋白酶2 h的酶解物TSPP其Fe2＋結合率最高（（83.47±0.1）%），且顯著高于酪蛋白酶解物（46.66±0.68）%和谷胱甘肽（17.71±0.46）%（P＜0.05）。

圖1 不同蛋白酶的水解度隨時間的變化Fig. 1 Changes in degree of hydrolysis of tilapia skin protein during hydrolysis with different proteases

圖2 各酶解物TSPP的Fe2＋結合率Fig. 2 Fe2+-chelating rates of hydrolysates with different hydrolysis times

綜合Fe2＋結合能力及水解度趨勢可知，TSPP的Fe2＋結合能力不隨水解度的增加而增加，酶解時間短不能完全酶解蛋白，而酶解時間過長，生成的游離氨基酸增加，降低結合活性。不同蛋白酶具有不同的酶活力及酶切位點，其對蛋白的水解程度不同，進而影響酶解物TSPP的分子質(zhì)量大小、氨基酸組成及氨基酸序列，胰蛋白酶作為肽鏈內(nèi)切酶，主要作用于肽鏈中精氨酸或賴氨酸殘基的羧基端[17]。根據(jù)圖2結果，胰蛋白酶2 h的酶解物TSPP具有最高的Fe2＋結合活性，因此選取胰蛋白酶2 h的TSPP進行下一步的實驗。

2.2 TSPP與Fe2＋結合條件的確定

TSPP與Fe2＋的配位結合反應受pH值、溫度、時間等因素的影響。由圖3可知，當pH值為7時，TSPP與Fe2＋的結合率極低；當pH值小于7時，結合率在結合反應的前90 min隨結合時間的延長而大幅度上升，且pH值為5時的結合率高于pH值為4和6的結合率；而在結合反應的90～180 min內(nèi)，結合率無顯著性變化，即結合反應基本完成，最佳的反應pH值為5，時間為90 min。在一定pH值范圍內(nèi)，隨著pH值升高，TSPP與Fe2＋的結合率升高，當pH值大于7時結合率降低，原因是在低pH值條件下，H＋易與Fe2＋競爭供電子基團，不利于TSPP-Fe2＋結合物的生成，而在高pH值條件下，羥基易與供電子基團爭奪Fe2＋而形成氫氧化物沉淀[18]。

圖3 不同pH值條件下結合率隨時間的變化Fig. 3 Changes in Fe2+-chelating rate over time under different pH conditions

圖4 不同溫度條件下結合率隨時間的變化Fig. 4 Changes in Fe2+-chelating rate over time under different temperature conditions

溫度既能夠引起TSPP構象的改變[19]，又能夠影響配位基團與金屬離子結合反應的熱力學參數(shù)[20]。在不同溫度條件下，TSPP的Fe2＋結合率隨著反應時間的動態(tài)變化如圖4所示，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，結合率升高，當溫度為37 ℃時，結合率最高，當溫度高于37 ℃時，結合率降低，即升高或降低溫度均造成鳀魚TSPP-Fe2＋結合能力的下降，該結果與Wu Haohao等[14]的結果一致。

因此，綜合pH值、溫度及時間考慮，pH 5、溫度37 ℃、反應時間90 min為最佳結合反應條件。

2.3 TSPP與Fe2＋結合過程的熒光光譜分析

在蛋白質(zhì)二級結構的研究中，內(nèi)源性熒光發(fā)射強度的下降是典型的肽鏈折疊后的現(xiàn)象，且當正電基團靠近肽鏈酪氨酸殘基的苯環(huán)結構時，蛋白質(zhì)內(nèi)源性熒光光譜會發(fā)生紅移[21]。圖5為激發(fā)波長為275 nm時，TSPP與Fe2＋結合反應過程的熒光發(fā)射光譜變化（290～500 nm）。由圖5A可知，隨著TSPP與Fe2＋結合反應的進行，TSPP的內(nèi)源性熒光強度逐漸下降，尤其是在結合反應的0～90 min內(nèi)，熒光強度明顯降低，且光譜發(fā)生了一定的紅移；90～150 min內(nèi)，熒光強度下降的幅度明顯減小，說明90 min后結合反應基本完成。由圖5B可知，當結合反應的pH值為5時，TSPP的內(nèi)源性熒光強度最低，說明在此pH值條件下，TSPP結合了Fe2＋，多肽鏈發(fā)生了折疊，且TSPP的內(nèi)源性熒光強度由小到大依次為pH 5＜pH 6＜pH 4＜pH 7。如圖5C所示，當結合反應的溫度為37 ℃，反應完成后TSPP的內(nèi)源性熒光強度最低。綜上可知，當反應的pH值為5、溫度為37 ℃、反應時間為90 min時，TSPP的內(nèi)源性熒光強度基本達到最低，即結合反應基本完成，與2.2節(jié)結果一致，即最佳的結合條件為：pH 5、溫度37 ℃、時間90 min。

圖5 不同條件下TSPP結合Fe2＋后其熒光強度的變化Fig. 5 Changes in fluorescence intensity of tilapia skin protein peptides(TSPP) after chelating with Fe2+ under different conditions

金屬離子在蛋白質(zhì)和多肽鏈的折疊過程中起重要作用，特別在肽鏈較短時，金屬離子可輔助TSPP在水溶液中形成熱力學穩(wěn)定的折疊結構[22]。Reddi等[23]研究也表明，TSPP與金屬離子的結合能可為TSPP的折疊提供能量輔助。肽鏈中含有的芳香族氨基酸如Phe、Trp和Tyr，可產(chǎn)生內(nèi)源性熒光，TSPP與Fe2＋發(fā)生結合反應后，肽鏈結構發(fā)生變化，熒光強度的降低可反映出肽-鐵結合物在形成過程中發(fā)生了肽的折疊[24]。本研究結果表明，F(xiàn)e2＋與肽鏈的結合引起了肽鏈折疊，形成TSPP-Fe2＋結合物，此結果與李博等[25]的研究結果一致。

2.4 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物的紫外光譜分析

在TSPP與金屬離子的結合反應中，TSPP作為配位體，結合金屬離子后，相應原子的價電子發(fā)生不同程度的躍遷，導致其紫外光吸收性能發(fā)生改變，由此證明TSPP與金屬離子之間發(fā)生了結合反應[26]。由圖6可知，F(xiàn)e2＋的乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）在230～350 nm波長處形成特征性的寬吸收帶，該溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，其紫外吸收光譜與乙酸鈉緩沖液的光譜基本一致，特征性吸收帶消失，說明Fe2＋在乙酸鈉緩沖液中水解形成了鐵氫氧化物沉淀。緩沖液＋TSPP＋Fe2＋的反應溶液在250～280 nm波長處形成特征性的吸收帶，且反應溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾前后，其紫外吸收帶基本一致，說明Fe2＋在含有TSPP的緩沖液中不水解形成鐵氫氧化物沉淀，此外，TSPP-Fe2＋結合物的紫外吸收帶與TSPP的相似，但出現(xiàn)紅移，說明TSPP介入了FeSO4在緩沖液中的水解過程，TSPP結合Fe2＋后，減少了溶液中鐵氫氧化物膠體粒子的形成，而形成新物質(zhì)TSPP-Fe2＋結合物，該結果與Wu Haohao等[27]研究結果相似。Yuan Biao等[28]研究也發(fā)現(xiàn)，灰樹花蛋白結合Fe2＋前后，其紫外最大吸收峰從194 nm移至192 nm，灰樹花-Fe2＋的最大吸收波長向短波方向移動，這可能是由于Fe2＋的結合過程中羰基氧原子的變化所致。

圖6 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物的紫外光譜Fig. 6 UV absorption spectra of TSPP and TSPP-Fe2+ complex

2.5 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物的紅外光譜分析

紅外光譜中基團特征性吸收峰的改變可反映出金屬離子與肽鏈中有機配位體的相互作用，且肽鏈中氨基、羰基、羧基的特征性吸收峰分別在3 300～3 600、1 600～1 700、1 400～1 500 cm-1左右[29]。由圖7可知，TSPP與Fe2＋結合后，在特征區(qū)，氨基的伸縮振動吸收峰從3 317.56 cm-1移動至3 315.63 cm-1；酰胺I帶即羰基的伸縮振動吸收峰從1 653.00 cm-1移動至1 656.85 cm-1；羧基反對稱伸縮振動吸收峰從1 533.41 cm-1移動到1 537.27 cm-1，其對稱伸縮振動峰從1 436.97 cm-1移動到1 440.83 cm-1，且吸收峰的強度均有所增加。由于結合前后，肽鏈結構構型的改變，引起了紅外吸收峰的移動變化，說明肽鏈中的氨基、羰基及羧基參與了Fe2＋的結合，進而形成了TSPP-Fe2＋結合物。Huang Guangrong等[30]通過紅外光譜發(fā)現(xiàn)蝦加工副產(chǎn)物水解產(chǎn)物的Fe2＋結合的位點主要對應于羧酸酯基團。Chen Qianru等[31]研究利用MS2技術發(fā)現(xiàn)Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Pro-Gly中組氨酸的咪唑環(huán)可能是潛在的Fe2＋結合位點。林慧敏等[32]利用核磁共振及紅外光譜結構表征顯示，肽鏈His-Tyr-Asp中的—NH—、—NH2以及末端—COOH上的—C＝O及—OH與Fe2＋發(fā)生結合，形成不穩(wěn)定結構的結合物。Wu Haohao等[27]發(fā)現(xiàn)鳀魚蛋白Fe3＋結合活性肽myosin1116-1127側鏈的羧基是Fe3＋的結合位點，即肽鏈羧基結合Fe3＋形成COO—Fe，再水解形成COO—Fe(OH)n，最后脫水縮合完成晶體形成。

圖7 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物紅外光譜Fig. 7 FTIR spectra of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

2.6 TSPP的分子質(zhì)量分布

圖8 TSPP的分子質(zhì)量分布Fig. 8 Molecular mass distribution of TSPP with different hydrolysis times

蛋白質(zhì)在不同的酶解時間下，生成的酶解物中含有各種不同分子質(zhì)量大小的TSPP，且每一種分子質(zhì)量的TSPP在不同酶解物中的含量不同。由圖8可知，隨著胰蛋白酶酶解時間的延長，羅非魚皮蛋白酶解物中大分子質(zhì)量（＞3 000 Da）的TSPP逐漸減少，小分子質(zhì)量（＜3 000 Da）的TSPP逐漸增多；且2 h的酶解物中500～3 000 Da之間的TSPP含量（90.40%）高于其他酶解時間點下同等分子質(zhì)量的酶解物。大部分研究表明分子質(zhì)量在1 500 Da范圍內(nèi)的多肽，其Fe3＋和Fe2＋結合活性較高，從豬血漿蛋白水解物中鑒定出的Fe2＋結合活性肽為1 055 Da[33]，從核桃蛋白水解物中分離鑒定的2 條Fe3＋結合活性肽的分子質(zhì)量分別為971.508 0 Da和1 357.648 0 Da[7]。結合2.2節(jié)的結果（胰蛋白酶2 h的TSPP-Fe2＋結合活性最高），推測出羅非魚皮蛋白Fe2＋結合活性肽的分子質(zhì)量很可能在500～3 000 Da之間。

2.7 TSPP氨基酸含量的分析

蛋白酶具有特殊的酶切位點，在酶解蛋白后可生成特殊氨基酸組成及序列的多肽，從而具有特殊的生物活性。由表2可知，羅非魚皮中Asp、Glu、Gly、Ala、Arg及Pro含量較高，羅非魚皮蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解2 h后得到的TSPP，上述6 種氨基酸在其酶解物中的含量均增加了3 倍左右，且高于其他氨基酸。根據(jù)路易斯規(guī)則，充當路易斯酸的Fe3＋和Fe2＋可以與富含氧或富含氮的基團（路易斯堿）反應，如Arg、Asn中的氨基等含氮基團或Glu、Asp中的羧基和磷酸基等含氧基團[34]。紀曉雯等[10]分離出的酪蛋白Fe2＋結合活性肽富含Glu、Asp、Gln。Budseekoad等[8]發(fā)現(xiàn)Pro-Ala-Ile-Asp-Leu與Fe2＋結合的能力可能與肽鏈中的Pro、Asp和Leu中的吡咯烷環(huán)、羧基和烷基的協(xié)同效應有關。Wu Haohao等[14]從鳀魚肌肉蛋白的胰蛋白酶水解物中分離并表征出的Fe3＋結合活性肽Ser-(Gly)7-Leu-Gly-Ser-(Gly)2-Ser-Ile-Arg、Ile-(Glu)2-Leu-(Glu)3-Ile-Glu-Ala-Glu-Arg，其Glu和Gly含量占肽鏈氨基酸總量60%及以上。綜上說明，酶解物中的Asp、Glu、Gly、Arg及Pro在Fe2＋結合活性中起重要作用。

表2 羅非魚皮和TSPP中氨基酸的成分及含量Table 2 Amino acid composition of tilapia skin protein and 2 h trypsin hydrolysate

2.8 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物的抗氧化能力分析

Fe2＋結合活性肽及肽-Fe2＋結合物的主要作用是促進鐵元素在人體中的吸收，除此之外，還具有抗氧化活性[35]。由圖9可知，5 mg/mL質(zhì)量濃度下的TSPP對DPPH自由基具有一定的清除能力，且胰蛋白酶各酶解時間點下的TSPP，其DPPH自由基清除能力均高于其他蛋白酶的TSPP；此外，TSPP結合Fe2＋形成TSPP-Fe2＋結合物后，其DPPH自由基清除率由42.47%降低為37.63%，變化不顯著，但均顯著低于谷胱甘肽（95.97%）。由圖10可知，在Trolox等效抗氧化能力中，堿性蛋白酶酶解8 h TSPP的等效抗氧化能力高于其他TSPP，此外，TSPP結合Fe2＋后，其Trolox等效抗氧化能力從0.014 2 mmol/L降低為0.011 5 mmol/L，均顯著低于谷胱甘肽（0.849 1 mmol/L）。研究指出，TSPP的抗氧化活性與肽鏈中的氨基酸組成及含量息息相關，大多數(shù)抗氧化肽富含Trp、Phe、Leu、Gly、Val等疏水性氨基酸以及Tyr、Phe、Trp等芳香族氨基酸，疏水性氨基酸殘基通過提供電子或供體電子穩(wěn)定活性自由基，芳香族氨基酸殘基可作為氫供體，抑制自由基介導的過氧化鏈反應，肽的支鏈氨基酸（Val、Leu和Ile）和非極性脂肪族氨基酸（Leu和Ala）對肽的抗氧化活性也有很大的貢獻[36-38]。綜合TSPP氨基酸組成及含量的結果，TSPP中主要含有Asp、Glu、Gly、Arg及Pro，在Fe2＋結合活性中，TSPP的結合活性高于谷胱甘肽，而在抗氧化活性中，谷胱甘肽的活性高于TSPP，由此說明，不同的TSPP具有不同的氨基酸組成及含量，決定其特殊的生物活性。

圖9 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物的DPPH清除活性Fig. 9 DPPH scavenging activity of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

圖10 TSPP及TSPP-Fe2＋結合物的Trolox等效抗氧化能力Fig. 10 Trolox equivalent antioxidant capacity of TSPP and TSPP-Fe2+ complexes

3 結 論

本實驗以羅非魚皮為原料，進行了羅非魚皮蛋白TSPP-Fe2＋結合物的制備及其結合條件、結構特征、生物活性的探究。結果發(fā)現(xiàn)，TSPP的Fe2＋結合活性不隨蛋白水解度的增加而增加，且胰蛋白酶酶解2 h的TSPP，其Fe2＋結合率最高；TSPP與Fe2＋的結合率受pH值、溫度和時間的影響，當pH值為5、溫度為37 ℃、時間為90 min時，結合反應基本完成；TSPP結合Fe2＋后，其內(nèi)源性熒光強度降低且光譜發(fā)生紅移，說明結合后，肽鏈發(fā)生了折疊；TSPP結合Fe2＋前后，其紫外光吸收帶的位移表明TSPP結合Fe2＋后形成了新物質(zhì)；根據(jù)TSPP及TSPP-Fe2＋結合物的紅外光譜推測出肽鏈中的氨基、羰基、羧基參與了Fe2＋的結合；TSPP中的Fe2＋結合活性肽，其分子質(zhì)量大約在500～3 000 Da之間；此外，肽鏈中的Asp、Glu、Gly、Arg及Pro在Fe2＋結合活性中起關鍵作用；TSPP具有一定的抗氧化能力，但TSPP的抗氧化能力顯著低于谷胱甘肽，而其Fe2＋結合能力顯著高于谷胱甘肽，說明不同的肽段具有不同的氨基酸組成及含量，進而決定了其生物活性的特異性。由于蛋白酶解物中含有各種不同分子質(zhì)量大小及氨基酸組成的肽段，需對其進行分離純化、序列鑒定以及生物利用度的測定，以期為膳食鐵元素補充劑的研究及開發(fā)提供依據(jù)。