胡永芯，李 欣，程劍鋒，馬 鑫，孟軒夷，陳紅兵，武 涌,

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

近年來(lái)，隨著食物的多樣化以及人們生活方式的改變，在澳大利亞、美國(guó)、英國(guó)、中國(guó)等國(guó)家的調(diào)查均顯示食物過(guò)敏發(fā)生率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1]。經(jīng)世界衛(wèi)生組織與聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織認(rèn)定的主要過(guò)敏食物包括牛乳、雞蛋、花生、魚(yú)、甲殼類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物、大豆、小麥和堅(jiān)果。在發(fā)達(dá)國(guó)家大約有3%的成年人和8%的兒童患有食物過(guò)敏，在美國(guó)，2.4%的兒童對(duì)多種食物過(guò)敏[2]。歐洲一項(xiàng)志愿者自述性調(diào)查顯示，食物過(guò)敏發(fā)病率為6%[3]。

食物致敏原是引起食物過(guò)敏的元兇，指在食物中能被特異性免疫細(xì)胞識(shí)別并引發(fā)免疫應(yīng)答的成分?？乖肿优c抗體反應(yīng)或被抗原受體識(shí)別，并引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的特殊化學(xué)基團(tuán)稱(chēng)為表位，即抗原決定簇。表位按照氨基酸的組成結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為線性表位和構(gòu)象性表位。線性表位也稱(chēng)順序表位或連續(xù)表位，是氨基酸殘基線性排列組成的表位。構(gòu)象性表位也稱(chēng)不連續(xù)表位，是氨基酸殘基在空間相互靠近時(shí)形成的能被免疫活性物質(zhì)識(shí)別的特定三維結(jié)構(gòu)。按照表位受體的不同可分為T(mén)細(xì)胞表位與B細(xì)胞表位。T細(xì)胞抗原受體（T-cell receptor，TCR）只識(shí)別經(jīng)過(guò)抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）處理，并以肽-主要組織相容性復(fù)合體（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）形式呈現(xiàn)于細(xì)胞膜表面的表位，由于抗原的空間構(gòu)象在抗原提呈、加工過(guò)程中多被破壞，因此T細(xì)胞表位都是線性表位。而B(niǎo)細(xì)胞抗原受體（B-cell receptor，BCR）具有識(shí)別完整抗原的能力，因此B細(xì)胞表位既有構(gòu)象性表位也有線性表位。食物致敏原的B細(xì)胞表位大多是蛋白質(zhì)表位，鮮少有關(guān)于碳水化合物表位的報(bào)道[4]。

1 T細(xì)胞表位

1.1 T細(xì)胞表位的類(lèi)型

T細(xì)胞表位指特定抗原經(jīng)過(guò)APC處理后，結(jié)合至少一個(gè)MHC分子并以pMHC復(fù)合物形式在APC表面表達(dá)，能被T細(xì)胞受體識(shí)別并觸發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的肽[5]。T細(xì)胞表位都是線性表位，不能與免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）結(jié)合。pMHC復(fù)合物的形成有MHC I類(lèi)和MHC II類(lèi)兩種途徑，分別被CD8+和CD4+T細(xì)胞識(shí)別。來(lái)自細(xì)胞外的抗原稱(chēng)為外源性抗原，如食物致敏原，其經(jīng)APC加工后與MHC II類(lèi)分子形成的復(fù)合物被CD4+T細(xì)胞的TCR識(shí)別。MHC II類(lèi)分子結(jié)合長(zhǎng)度為10～30 個(gè)氨基酸殘基的肽段，最佳長(zhǎng)度為12～16 個(gè)氨基酸[6]。CD4+T細(xì)胞在食物過(guò)敏的引發(fā)和維持中起關(guān)鍵作用[7]。

1.2 T細(xì)胞表位的定位方法

目前，T細(xì)胞表位的定位方法發(fā)展迅速，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)和輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）抗原表位的預(yù)測(cè)。研究表明，pMHC II類(lèi)復(fù)合物與TCR的結(jié)合是初始CD4+T細(xì)胞分化為促炎Th2的關(guān)鍵[8]。Th2能產(chǎn)生白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，IL-4、IL-13能促進(jìn)IgE生成，IL-4和IL-5分別在嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的募集和啟動(dòng)中起重要作用[9]。Th2和其他T細(xì)胞亞群在過(guò)敏反應(yīng)中的病理作用以及誘導(dǎo)耐受性作用在過(guò)去的幾十年里已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前對(duì)于食物致敏原T細(xì)胞表位的研究較為廣泛，可采用T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)[10-11]、四聚體引導(dǎo)表位作圖法[12]、免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)法等進(jìn)行表位鑒定。

1.2.1 T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

正常人體內(nèi)的Th1/Th2存在平衡，當(dāng)機(jī)體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)時(shí)，此平衡被打破。因此T細(xì)胞表位可通過(guò)T細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞因子變化來(lái)確定。首先合成包含全部蛋白質(zhì)序列的重疊多肽，一般長(zhǎng)度為15～20 個(gè)氨基酸，重疊3～5 個(gè)氨基酸[13]，然后將合成肽刺激T細(xì)胞后檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況，由此可確定T細(xì)胞表位。由于過(guò)敏患者外周血單核細(xì)胞中抗原特異性CD4+T細(xì)胞的數(shù)量較少，很難觀察到明顯的增殖情況，比如花生過(guò)敏患者的Ara h 1特異性T細(xì)胞的含量為百萬(wàn)分之九，即每1 000 000 個(gè)T細(xì)胞中只有9 個(gè)Ara h 1特異性T細(xì)胞[14]。目前大多數(shù)研究使用的是外周血單核細(xì)胞中分離培養(yǎng)的T細(xì)胞系（T-cell line，TCL）或T細(xì)胞克隆。T細(xì)胞增殖情況的檢測(cè)可采用熒光染色和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunospot，ELISPOT）等方法。熒光染色法通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來(lái)觀察細(xì)胞分裂增殖的情況，可與其他啟動(dòng)標(biāo)記物組合使用，但大量旁觀者T細(xì)胞（bystander T cells）會(huì)影響結(jié)果[15-16]。ELISPOT通過(guò)特異性抗體捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，再利用顯色法展示結(jié)果來(lái)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的分泌情況，最終確定能刺激T細(xì)胞增殖的表位[17]。

T細(xì)胞增殖法在食物致敏原T細(xì)胞表位定位中的運(yùn)用非常廣泛，這些食物包括巴西堅(jiān)果、桃子、花生[18]、蝦[19]、牛奶[20]等。Wai等在一項(xiàng)定位‘刀額新對(duì)蝦’的免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位研究中，合成了18 個(gè)長(zhǎng)度為20 個(gè)氨基酸、重疊5 個(gè)氨基酸的包含Met e 1全部序列的重疊肽，使用重疊肽刺激從Met e 1致敏的BALB/c小鼠分離出的脾細(xì)胞并檢測(cè)刺激后的細(xì)胞因子變化，最終鑒定出6 個(gè)主要的Met e 1 T細(xì)胞表位[19]。Gouw等利用MHC II結(jié)合法識(shí)別出人類(lèi)白細(xì)胞抗原-DRB1（human leucocyte antigen-DRB1，HLA-DRBI）限制肽，并通過(guò)人類(lèi)TCL的增殖情況鑒定出13 個(gè)長(zhǎng)度為9 個(gè)氨基酸的β-乳球蛋白的肽段，證明合成肽段能被牛乳蛋白特異性TCL識(shí)別并誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[20]。

1.2.2 四聚體引導(dǎo)表位作圖法

四聚體引導(dǎo)表位作圖（tetramer-guided epitope mapping，TGEM）是一種免疫學(xué)技術(shù)，利用肽和HLA II類(lèi)的四聚體和染色試劑，通過(guò)肽段篩選程序快速識(shí)別致敏表位[21]。運(yùn)用TGEM的兩個(gè)前提是已知個(gè)體的HLA表現(xiàn)型和抗原的重疊肽庫(kù)[22]。TCR與pMHC之間的相互作用較弱，通常僅持續(xù)幾秒鐘，但可溶性pMHC形成四聚體后，會(huì)延長(zhǎng)相互作用的半衰期[23]。首先，可溶性MHC II類(lèi)單體與肽段的羧基端連接，通過(guò)熒光標(biāo)記的鏈霉親和素組裝成能被特異性TCR識(shí)別的pMHC四聚體。然后四聚體與CD4+T細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞中的APC相互作用，使CD4+T細(xì)胞也被染色，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選陽(yáng)性染色T細(xì)胞克隆，使致敏原特異性T細(xì)胞得以回收。最后將陽(yáng)性染色的肽段分別加載到MHC II類(lèi)單體上，重復(fù)染色[22]。TGEM法特異性和靈敏性高，但價(jià)格昂貴，一般需要使用患者血清進(jìn)行體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。TGEM法可以與多種技術(shù)同時(shí)使用，如同時(shí)對(duì)MHC四聚體和胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行染色是一種研究表位特異性CD4+T細(xì)胞的優(yōu)化方案[24-25]。但許多HLA II類(lèi)分子不容易被分離，限制了TGEM法的應(yīng)用[26]。

Delong等利用HLA II類(lèi)分子與花生致敏原Ara h 1肽形成的特異性四聚體測(cè)定Ara h 1反應(yīng)性T細(xì)胞的水平、表型和細(xì)胞因子譜[14]。有研究者采用TGEM法鑒定出核桃致敏原Jug r 2的多個(gè)CD4+T細(xì)胞表位并構(gòu)建了Jug r 2特異性T細(xì)胞克隆系[27]。Archila等利用TGEM法鑒定了幾個(gè)Ana o 1和Ana o 2衍生的表位，并測(cè)定了腰果特異性T細(xì)胞的表型和功能，明確了過(guò)敏患者具有顯著的Th2表型，接著采用四聚體染色技術(shù)和T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)探究Ana o 1和Ana o 2的特異性T細(xì)胞克隆對(duì)其他種類(lèi)堅(jiān)果的交叉反應(yīng)活性[28]。

1.2.3 免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)法

免疫信息學(xué)是生物信息學(xué)的一個(gè)新分支，可用于預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位。T細(xì)胞表位與MHC分子形成pMHC復(fù)合物后才能被識(shí)別，肽和MHC分子之間的親和力與肽段免疫原性有很強(qiáng)的相關(guān)性[29]，故可通過(guò)pMHC復(fù)合物的親和力來(lái)間接預(yù)測(cè)表位，稱(chēng)為MHC分子親和肽預(yù)測(cè)法，可分為基于結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)兩類(lèi)[30]?；诮Y(jié)構(gòu)法通常先建立pMHC結(jié)構(gòu)模型，再通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬、加權(quán)直方圖分析等方法評(píng)估pMHC II類(lèi)復(fù)合物的結(jié)合親和力[31-32]。此法優(yōu)勢(shì)在于不需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，但計(jì)算量龐大且比基于數(shù)據(jù)法的準(zhǔn)確性低，在篩選大型蛋白中的應(yīng)用受到限制[33-34]。數(shù)據(jù)法是基于MHC分子與已知序列多肽的結(jié)合強(qiáng)度來(lái)預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位。多肽序列一般來(lái)源于IEDB[35]、EPIMHC[36]、AntiJen[37]等表位數(shù)據(jù)庫(kù)。肽段與MHC分子的親和力強(qiáng)弱通過(guò)與結(jié)合親和力閾值對(duì)比確定，結(jié)合親和力閾值指肽段的半最大抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），即MHC結(jié)合到一半時(shí)肽段的濃度。一般IC50小于50 nmol/L為強(qiáng)親和力，IC50小于500 nmol/L為弱親和力[5]。

MHC分子親和肽預(yù)測(cè)中廣泛運(yùn)用到機(jī)器學(xué)習(xí)算法，如支持向量機(jī)（support vector machines，SVM）、特定位置評(píng)分矩陣（position-specific scoring matrices，PSSM）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural networks，ANN）和隱馬爾科夫模型（hidden Markov models，HMM）等?；跈C(jī)器算法來(lái)預(yù)測(cè)CD4+T細(xì)胞表位的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器有NetMHC II[38]、NetMHC IIpan[39]、TEPITOPE[40]、 TEPITOPEpan[41]、 ProPred[42]、RANKPEP[43]和SVRMHC[44]等，具體如表1所示。

其中，NetMHC II和NetMHC IIpan目前被認(rèn)為是預(yù)測(cè)肽段與MHC II類(lèi)分子結(jié)合親和力的最佳途徑[45-46]，兩者的主要區(qū)別在于預(yù)測(cè)MHC范圍不同。NetMHC II是每個(gè)MHC分子獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)的集合，只能預(yù)測(cè)候選庫(kù)里的肽段與MHC分子的結(jié)合親和力。而NetMHC IIpan包含一個(gè)單一的通用網(wǎng)絡(luò)，可以預(yù)測(cè)已知蛋白序列的肽和所有MHC分子的結(jié)合親和力[38]。后者運(yùn)用范圍更加廣泛，如HLA有上百種I類(lèi)（HLA I）和II類(lèi)（HLA II）分子的等位變異，其會(huì)結(jié)合不同的肽，通過(guò)輸入親和力數(shù)據(jù)到NetMHC IIpan來(lái)預(yù)測(cè)未鑒定的HLA與肽的結(jié)合親和力[47-48]。

以花生致敏原表位為例，Pascal等利用NetMHC IIpan-2.0和NetMHC II-2.2算法預(yù)測(cè)Ara h 1和Ara h 2肽與MHC II類(lèi)分子的結(jié)合位點(diǎn)，鑒定出Ara h 2的4 種能誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)肽，分別是氨基酸1～4、氨基酸5～9、氨基酸17～22和氨基酸24～27，特別地，氨基酸1～3、氨基酸19～21和氨基酸25～26被預(yù)測(cè)為強(qiáng)結(jié)合[49]。Ramesh等通過(guò)使用此測(cè)定法預(yù)測(cè)了Ara h 1的36 種肽段并確定了4 種可用于研發(fā)疫苗的Ara h 1候選肽[50]。

2 B細(xì)胞表位

2.1 B細(xì)胞表位的類(lèi)型

B細(xì)胞受體或B細(xì)胞分泌的特異性抗體識(shí)別的表位均稱(chēng)為B細(xì)胞表位，可分為線性表位與構(gòu)象性表位：線性表位是由一些序列連續(xù)的氨基酸殘基通過(guò)肽鍵形成的多肽；構(gòu)象性表位由在序列上不連續(xù)，通過(guò)多肽鏈折疊在空間上相互接近的氨基酸殘基或肽段組成。據(jù)報(bào)道，90%的B細(xì)胞表位是構(gòu)象性的，在分析了來(lái)自AbDb數(shù)據(jù)庫(kù)的488 個(gè)抗原-抗體復(fù)合物后，發(fā)現(xiàn)可能只有4%的表位是線性表位[51]。線性表位與構(gòu)象性表位并非完全獨(dú)立，某些線性表位是構(gòu)象性表位的組成部分。在食物過(guò)敏中，構(gòu)象性表位發(fā)揮作用較少，因?yàn)槭澄镏旅粼ǔ?huì)受到熱加工變性和胃腸道消化的影響，從而使構(gòu)象性表位被破壞[52]。B細(xì)胞構(gòu)象性表位相對(duì)線性表位更復(fù)雜，因此預(yù)測(cè)B細(xì)胞構(gòu)象性表位更困難，許多方法都很難將抗體與構(gòu)象性表位的相互作用展示出來(lái)。對(duì)構(gòu)象性表位的表征需要復(fù)雜的技術(shù)，例如合成肽技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、X射線晶體學(xué)、質(zhì)譜法、氨基酸定點(diǎn)突變和嵌合蛋白法等。

2.2 B細(xì)胞表位的定位方法

2.2.1 合成肽技術(shù)

合成肽法是研究B細(xì)胞線性表位的常見(jiàn)方法，成功率較高且操作簡(jiǎn)單。首先在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，再合成一系列包含整個(gè)氨基酸序列的末端相互重疊的肽段，每段都對(duì)應(yīng)蛋白抗原線狀序列中的一小段。肽鏈長(zhǎng)度一般為15～20 個(gè)氨基酸，重疊氨基酸的數(shù)量根據(jù)肽鏈長(zhǎng)度和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定，也可預(yù)先進(jìn)行表位預(yù)測(cè)或基因片段分析，用于指導(dǎo)合成表位候選區(qū)肽段[53]。合成肽法與氨基酸替代法結(jié)合可用于鑒定抗原表位的關(guān)鍵氨基酸殘基，其中丙氨酸常作為替代氨基酸[54]，也有其他氨基酸作為替代，如甘氨酸等，這取決于設(shè)計(jì)目的。多肽合成后要驗(yàn)證肽段的純度和序列，可采用反相高效液相色譜法和質(zhì)譜法。通常選用硝化纖維膜作為合成肽的固體載體，通過(guò)合成肽段與患者血清進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)來(lái)確定表位。近年來(lái)，多肽微陣列芯片法已被開(kāi)發(fā)出來(lái)，即采用微量點(diǎn)樣的方法將多肽有序固定在載玻片表面，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子反應(yīng)，通過(guò)特定的儀器進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析。多肽微陣列芯片技術(shù)只消耗微升量的血清，卻能同時(shí)測(cè)定數(shù)千個(gè)靶點(diǎn)，大大降低了測(cè)定單個(gè)生物學(xué)樣品的成本，促進(jìn)了表位的高通量篩選，并且獲得的數(shù)據(jù)也很可靠，但只能定位線性表位，不能用于探究構(gòu)象性表位。隨著多肽微陣列芯片技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在其已成為高通量識(shí)別線性表位和診斷食物過(guò)敏的有力工具[55]。

Shreffler等首次使用基于肽微陣列的免疫分析方法繪制花生表位[56]。目前利用多肽芯片技術(shù)已經(jīng)確定了一些可作為候選生物標(biāo)記物的多肽，用于食物過(guò)敏早期診斷和預(yù)測(cè)其嚴(yán)重程度或耐受性建立[57]，如牛乳中的3 種酪蛋白和β-乳球蛋白[58]。Lin Jing等開(kāi)發(fā)和優(yōu)化了一種可靠、靈敏的多肽微陣列免疫分析方法，并應(yīng)用于多種食品致敏原IgE表位的標(biāo)測(cè)，已成功地繪制了一系列食物致敏原的抗原表位，如花生/樹(shù)堅(jiān)果、牛奶、蝦、大豆等[59]。Cerecedo等基于多肽微陣列的免疫測(cè)定對(duì)牛乳中酪蛋白的IgE和IgG4結(jié)合表位進(jìn)行了定位，獲得了αs2-酪蛋白的7 個(gè)表位、κ-酪蛋白的4 個(gè)表位和β-酪蛋白的2 個(gè)表位[60]。Otsu等通過(guò)多肽微陣列技術(shù)鑒定了Ara h 2的IgE線性表位，并與Ara h 2進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)臨床癥狀更嚴(yán)重患者的血清IgE識(shí)別更少的Ara h 2和Ara h 6線性表位[61]。

2.2.2 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是一種從隨機(jī)多肽庫(kù)中篩選表位的技術(shù)。通過(guò)篩選噬菌體展示肽庫(kù)或化學(xué)合成的組合多肽庫(kù)得到的表位通常稱(chēng)為模擬表位，包含線性表位和構(gòu)象性表位[62]。噬菌體展示系統(tǒng)的原理是將外源目的編碼基因插入到噬菌體衣殼蛋白基因中，使噬菌體衣殼蛋白上展示外源蛋白或肽段，因此實(shí)現(xiàn)了基因型與表型的統(tǒng)一[63]。在噬菌體展示系統(tǒng)中最常用的噬菌體是M13[64]和T7[65]。自從1985年Smith首次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因pIII中建立該方法以來(lái)[66]，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為鑒定和表征與特定分子（如抗體）結(jié)合的模擬肽的強(qiáng)大工具。使用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行食物致敏原表位定位的第一步是選擇合適的噬菌體肽庫(kù)。食物致敏原研究中通常使用由長(zhǎng)度為7～12 個(gè)氨基酸的肽組成的肽庫(kù)[67]。接著對(duì)噬菌體肽庫(kù)進(jìn)行3～5 輪的生物淘選，篩選出與目標(biāo)靶分子特異性結(jié)合的高度富集噬菌體。最后進(jìn)行噬菌體測(cè)序得到序列信息，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析獲得表位相關(guān)信息。噬菌體展示技術(shù)法識(shí)別模擬表位的速度很快，不需要復(fù)雜的晶體，但模擬表位的識(shí)別可能會(huì)脫靶，且需要復(fù)雜的計(jì)算機(jī)建模來(lái)分析數(shù)據(jù)，因此噬菌體展示技術(shù)與機(jī)器算法相結(jié)合是一種識(shí)別致敏原構(gòu)象性表位的有效方法[68]。

Li Xin等利用噬菌體環(huán)七肽庫(kù)（Ph.D.-C7C）篩選β-乳球蛋白的模擬表位，通過(guò)Peptiope服務(wù)器的Mapitope算法計(jì)算相應(yīng)的構(gòu)象表位，首次鑒定出線性表位和構(gòu)象性表位各自的共同氨基酸殘基[69]。接著從噬菌體肽庫(kù)（Ph.D.-12和Ph.D.-C7C）中獲得牛乳α-乳白蛋白上的線狀和構(gòu)象的模擬表位，使用UniProt比對(duì)工具鑒定出6 個(gè)IgE和7 個(gè)IgG線性表位，用PyMOL檢測(cè)到5 個(gè)IgE和3 個(gè)IgG構(gòu)象性表位[70]。此外，噬菌體展示技術(shù)在牛乳β-酪蛋白[71]、小龍蝦肌球蛋白輕鏈[72]、青蟹肌漿蛋白[73]、雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、桃子Pru p 3蛋白、花生Ara h 1蛋白等食物致敏原表位定位中的應(yīng)用均有報(bào)道。

2.2.3 X射線晶體學(xué)

隨著生物物理技術(shù)的發(fā)展，X射線晶體學(xué)分析、質(zhì)譜、核磁共振技術(shù)等在B細(xì)胞線性和構(gòu)象性表位定位中發(fā)揮著重要作用。由于核磁共振技術(shù)使用時(shí)，通常需要用15N和13C標(biāo)記原子核，且只能分析分子質(zhì)量較小的靶抗原（＜30 kDa），因此其應(yīng)用受到限制。在食物致敏原表位定位中，X射線晶體學(xué)分析和質(zhì)譜的應(yīng)用更廣泛[74]。

基于抗原-抗體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的X射線晶體學(xué)分析是定位構(gòu)象性表位的最理想、最精準(zhǔn)的方法[75]。X射線晶體學(xué)分析涉及抗原和單抗的純化、抗原-單抗復(fù)合物的形成與純化以及復(fù)合物的晶體學(xué)解析等過(guò)程[76]。獲得抗原抗體復(fù)合物的結(jié)晶后，通過(guò)X射線晶體學(xué)或核磁共振波譜分析抗原-抗體復(fù)合物，可得到表位的結(jié)構(gòu)，并確定與抗體殘基接觸的原子。Albillos等通過(guò)X-ray技術(shù)研究杏仁種子中致敏原Pru 1的致敏性，得到了純度高、結(jié)構(gòu)清晰的蛋白結(jié)晶，有助于在分子水平上進(jìn)一步表征植物種子中11S球蛋白致敏原的致敏性[77]。如果兩個(gè)原子間距離小于4 ?，則表示兩個(gè)殘基之間發(fā)生了接觸，由此可獲得構(gòu)象性表位[72]。目前此法只針對(duì)抗原與單克隆抗體的研究，適用于細(xì)菌或病毒抗原，特別是可溶性小蛋白的研究。但此法在食物致敏原研究中的運(yùn)用并不廣泛，原因是較難獲得高純度的食物致敏原-抗體結(jié)晶，而且難以從食物過(guò)敏患者血清中獲得大量特異性IgE抗體，有研究用致敏BALB/c小鼠雜交細(xì)胞產(chǎn)生的IgG代替患者血清IgE[78]。

2.2.4 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的表位定位技術(shù)，用于確定與溶液中抗體相互作用的可溶性抗原的表位。利用免疫親和技術(shù)分離出與抗體結(jié)合的抗原肽段后，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定含有抗原表位的肽段，最后與抗原天然序列對(duì)比獲得表位信息。最常用于獲取抗原肽段的方法是酶解法，有“表位切除”和“表位提取”兩種方法。前者是將抗原與抗體免疫共沉淀后用蛋白酶水解，抗原表位與抗體結(jié)合的部位會(huì)受到保護(hù)而不被酶解，后者是將抗原用蛋白酶消化后進(jìn)行免疫共沉淀[79]?！氨砦磺谐焙汀氨砦惶崛　背绦蚓乖谌芤褐械乃膺^(guò)程以及從免疫復(fù)合物中除去未結(jié)合成分的各種洗滌步驟，且兩種方法均能有效地篩選酶解后的抗原表位部分[80]。氕/氘交換-質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)提高了質(zhì)譜表位作圖的精確度，但仍低于X射線晶體學(xué)技術(shù)的準(zhǔn)確度。腰果致敏原7S球蛋白（Ana o 1）的表位通過(guò)氕/氘交換-質(zhì)譜被揭示，在比較了重組Ana o 1和與mAb 2G4結(jié)合的Ana o 1 的氕/氘交換信息后，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)線性表位優(yōu)勢(shì)區(qū)域，其中有兩個(gè)區(qū)域是構(gòu)象性表位的組成部分[81]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表位后，結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果對(duì)比分析也是一種可行的思路，已經(jīng)在小麥致敏原CM16線性B細(xì)胞表位的定位中得到驗(yàn)證[82]。

2.2.5 氨基酸定點(diǎn)突變和嵌合蛋白法

氨基酸定點(diǎn)突變和嵌合蛋白法都是研究IgE表位的常用方法，經(jīng)常結(jié)合使用。氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)是指人工替換抗原序列上的某個(gè)氨基酸，然后比較突變型抗原和野生型抗原與抗體的識(shí)別情況，以此為依據(jù)鑒定表位[83]。叢艷君等利用合成肽法初步獲得牛乳致敏原α-乳白蛋白的表位，再用丙氨酸依次取代作用表位的氨基酸合成新的多肽，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附分析法識(shí)別出表位的關(guān)鍵氨基酸[84]。

重組蛋白是指利用基因重組技術(shù)將抗原蛋白的某一DNA區(qū)域插入載體蛋白的相關(guān)DNA區(qū)域，隨后在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白。利用免疫測(cè)定法測(cè)定表達(dá)的重組蛋白，以確定抗體結(jié)合區(qū)域。此法已經(jīng)成功用于腰果致敏原Ana o 3抗原表位的解析，關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)重組蛋白也為過(guò)敏患者血清特異性IgE的檢測(cè)提供了新的思路[85]。Alcocer等通過(guò)替換結(jié)構(gòu)域上的蛋白構(gòu)建了幾種嵌合蛋白，將巴西堅(jiān)果致敏原Ber e 1的部分蛋白置換成結(jié)構(gòu)相似但致敏性更低的向日葵種子蛋白。嵌合蛋白的圓二光譜顯示出其與天然對(duì)照物具有相似的α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)表達(dá)過(guò)程中沒(méi)有受到影響[86]。

2.2.6 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)法

近年來(lái)，B細(xì)胞表位作圖技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，極大地促進(jìn)了免疫信息學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們可以在免疫學(xué)中應(yīng)用計(jì)算機(jī)來(lái)揭示抗體、B細(xì)胞和致敏原的結(jié)構(gòu)，便于在分子層面進(jìn)一步研究抗原-抗體復(fù)合物形成過(guò)程。通過(guò)各種網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對(duì)B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)有助于更精確地定位B細(xì)胞表位。B細(xì)胞表位數(shù)據(jù)庫(kù)綜合了大量可供用戶(hù)搜索的數(shù)據(jù)，可分為IEDB、AntiJen等綜合型數(shù)據(jù)庫(kù)，BciPep、Epitome、SDAP、SEDB等B細(xì)胞專(zhuān)屬數(shù)據(jù)庫(kù)[87-88]。

B細(xì)胞線性表位預(yù)測(cè)主要基于二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，如局部親水性、表面可及性、可塑性、抗原性等[89]。早期多使用單參數(shù)方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，但局限性較大且效果較差。為了提高預(yù)測(cè)性能，常結(jié)合多種致敏原特征進(jìn)行綜合分析，并提出了基于HMM、ANN和SVM等機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，其中最常使用的是SVM[90]。目前常用的B細(xì)胞線性表位預(yù)測(cè)服務(wù)器有ABCPred[91]、BepiPred[92]、BCPred[93]、SVMTriP[94]、LBtope[95]、APCPred[96]等（表2）。

表2 預(yù)測(cè)B細(xì)胞線性表位的服務(wù)器Table 2 List of available web servers for continuous B-cell epitope prediction

B細(xì)胞構(gòu)象性表位的預(yù)測(cè)相對(duì)于線性表位較困難，但隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)、生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)大、免疫信息學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)B細(xì)胞構(gòu)象性表位的預(yù)測(cè)工具應(yīng)運(yùn)而生。目前的研究方法主要基于三維結(jié)構(gòu)信息、抗原抗體結(jié)合時(shí)的特異性或模擬表位信息[97]。最早的結(jié)構(gòu)和溶劑可及性的表位預(yù)測(cè)服務(wù)器為CEP，要求使用PDB格式的的三維數(shù)據(jù)[98]，后來(lái)產(chǎn)生了DiscoTope、ElliPro、SEPPA等基于三維結(jié)構(gòu)的服務(wù)器。EpiPred通過(guò)抗體對(duì)抗原表位的特定傾向指數(shù)篩選表位殘基[99]。MIMOX、PEPITOPE、EPISEARCH等服務(wù)器基于模擬表位信息預(yù)測(cè)構(gòu)象性表位。目前經(jīng)常使用的預(yù)測(cè)服務(wù)器有EPCES[100]、DiscoTope[101]、PEPITO[102]、ElliPro[103]、SEPPA[104]、CBTOPE[105]、EPSVR[100]、MIMOX[106]、PEPITOPE[107]等，這些服務(wù)器要求的數(shù)據(jù)輸入格式不盡相同（表3）。

同源建模服務(wù)器SWISS-MODEL可對(duì)水牛β-乳球蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，結(jié)合噬菌體篩選的陽(yáng)性表位候選序列，經(jīng)過(guò)MIMOX作圖可獲得水牛的構(gòu)象性表位[108]。Mishra等共使用了10 個(gè)網(wǎng)絡(luò)工具，如ABCPred、BCPred、BepiPred、BcePred等，并結(jié)合多種方法鑒定了花生的7 種致敏原的B細(xì)胞表位，一共預(yù)測(cè)出26 個(gè)線性和18 個(gè)構(gòu)象性表位，發(fā)現(xiàn)大部分預(yù)測(cè)的B細(xì)胞殘基均處于卷曲區(qū)域，預(yù)測(cè)出的6 個(gè)線性表位與大豆、榛子、番茄、玉米、蘋(píng)果、香蕉等致敏原具有相似性，表明花生致敏原可能與某些已知的食物致敏原具有交叉反應(yīng)性[109]。B細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)工具也已成功運(yùn)用于預(yù)測(cè)日本沼蝦原肌球蛋白[110]、大豆主要過(guò)敏原Gly m Bd 28K[111]等食物致敏原B細(xì)胞線性或構(gòu)象性表位。

表3 預(yù)測(cè)B細(xì)胞構(gòu)象性表位的服務(wù)器Table 3 List of available web servers for discontinuous/conformational B-cell epitope prediction

3 結(jié) 語(yǔ)

致敏原表位定位是食物過(guò)敏研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，為研究致敏原的結(jié)構(gòu)與功能、致敏原與抗體反應(yīng)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。致敏原表位數(shù)據(jù)的完善可推進(jìn)食物過(guò)敏的發(fā)病和免疫耐受的機(jī)制研究，指導(dǎo)相關(guān)食物過(guò)敏的治療。其次，基于表位對(duì)食物致敏原進(jìn)行檢測(cè)能使檢測(cè)操作更簡(jiǎn)單、結(jié)果更靈敏，進(jìn)一步為過(guò)敏患者提供更為準(zhǔn)確的食物過(guò)敏標(biāo)簽。同時(shí)表位數(shù)據(jù)可指導(dǎo)食品企業(yè)精準(zhǔn)開(kāi)發(fā)低致敏性產(chǎn)品，最大限度保證過(guò)敏患者的安全食用。

致敏原表位的定位已經(jīng)通過(guò)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、TGEM法、合成肽技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、X射線晶體學(xué)、氨基酸定點(diǎn)突變等策略和技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。在生物信息學(xué)表位預(yù)測(cè)方面也有驚人的進(jìn)步。相信隨著各學(xué)科的不斷發(fā)展和科研人員的不斷努力，對(duì)食品蛋白結(jié)構(gòu)和致敏原免疫反應(yīng)活性的認(rèn)識(shí)將逐步提高，對(duì)食物致敏原表位的研究一定會(huì)取得突破性的進(jìn)展。