覃德明，肖艷萍，曹星衛(wèi)，胡龍華

（1.江西省婦幼保健院檢驗(yàn)科；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006）

B 族鏈球菌 （Group B Streptococcus，GBS），為革蘭陽性球菌，成雙或短鏈排列，常定植于女性生殖道和胃腸道，為條件致病菌。攜帶GBS 的孕婦一般無臨床癥狀，少數(shù)可引起絨毛膜羊膜炎、胎膜早破和產(chǎn)褥熱等疾病[1,2]。但令人擔(dān)憂的是，有研究報(bào)道,攜帶GBS 的孕婦在分娩時，可經(jīng)產(chǎn)道致6.3%[3,4]新生兒感染，引起新生兒肺炎、敗血癥和腦膜炎，甚至死亡等。分泌多種毒力因子是GBS 的主要致病因素，其中最主要的毒力因子是莢膜多糖（capsular polysaccharide,CPS）, 依據(jù) CPS 型特異性將GBS 分為（Ia-IX）10 個血清型[5,6]。攜帶的 GBS 血清型與孕婦種族、地域和疾病類型相關(guān)。孕婦產(chǎn)前常規(guī)GBS 篩查，并采用抗生素預(yù)防，是目前預(yù)防母嬰GBS 感染的主要方法,但可能引起細(xì)菌耐藥和過敏反應(yīng)，且并不能徹底清除GBS。理想預(yù)防GBS 的方法是疫苗[7]，血清分型是疫苗研制的基礎(chǔ)。為了解本地區(qū)孕婦攜帶GBS 情況, 對10145 例住院孕婦進(jìn)行了GBS 篩查及其CPS 血清型分析, 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本及菌株 采集2019 年6 月-11 月江西省婦幼保健院住院孕婦的生殖道分泌物樣本，共10145 例。進(jìn)行常規(guī)分離培養(yǎng)，共檢出149 株GBS,檢出率為1.47%； 隨機(jī)選取94 例孕婦攜帶的GBS進(jìn)行血清型分型。孕婦年齡20~42 歲，平均29.41±3.25 歲；孕周為 17~41 周；初產(chǎn)婦 50 例（53%），經(jīng)產(chǎn)婦 44 例（47%）。

1.2 儀器與試劑 一次性拭子（揚(yáng)州市創(chuàng)新醫(yī)療器械廠）；哥倫比亞培養(yǎng)基（奧賽飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）； 美國熱電CO2溫箱； 法國梅里埃VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統(tǒng)和配套GP 鑒定卡、AST-GP67 藥敏卡；北京全式金公司DNA 提取試劑盒(EasyPureRBacteria Genomic DNA Kit)和 PCR 反應(yīng)體系(2X TRANSsTartRFastPfu PCR Super Mix)； 賽默飛世爾公司VeritiTMDx 96-Well Thermal Cycler PCR 儀；北京市六一 DYY-6C 型電泳儀； 北京擎科生物科技有限公司杭州分公司合成引物； 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司紫外投射分析儀；北京擎科生物科技有限100bp DNA Ladder。

1.3 菌株分離與鑒定 取孕婦生殖道分泌物，在2h內(nèi)送檢。標(biāo)本接種于哥倫比亞血瓊脂平板，分區(qū)劃線后將平板放置于 5%CO2溫箱，35℃培養(yǎng) 18~24h。挑取可疑菌落做革蘭染色和觸酶試驗(yàn)進(jìn)行初篩，使用VITEK 2 Compact 進(jìn)行菌株鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)，同時做CAMP 試驗(yàn)。

1.4 菌株DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物分析

1.4.1 DNA 提取 將收集的菌株復(fù)蘇，轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板，挑取3~5 個菌落接種于裝有3ml 腦心浸液（BHI）瓊脂肉湯試管,35℃、振搖 18~24h,取1ml 混懸液于 1.5mlEP 管，按 DNA 提取試劑盒步驟提取DNA。

1.4.2 PCR 擴(kuò)增 25μl 反應(yīng)體系（2X multiplex PCR Mix 12.5μl,DNA 模板 2.5μl,引物(10pmol/μl)：0.1μl/條（1 號和 16 號為 0.2μl/條）,ddH2O 7.9μl）,反應(yīng)步驟：預(yù)變性（95℃，15min）,35 個循環(huán)（95℃、30s,57℃、60s，72℃、60s），延伸（72℃、10min）。

1.4.3 產(chǎn)物電泳 取5μl 擴(kuò)增產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠孔中，電壓140V，時長35min，結(jié)束后取出凝膠放置于紫外分析儀下讀取結(jié)果且拍照。

2 結(jié)果

2.1 GBS 菌株分離情況 2019 年 6 月-11 月共篩查了10145 例住院孕婦生殖道分泌物，共檢出149株GBS,檢出率為1.47%。

2.2 GBS 分型結(jié)果 部分電泳結(jié)果，見圖1,血清型分型依照表1。選取94 例孕婦攜帶的GBS 成功分出 7 個血清型,分別為 Ib 型 33 株(35.1%)，III 型 25株(26.6%)，Ia 型 22 株(23.4%)，V 型 5 株(5.3%)，II型和 VI 型各 4 株(4.3%)，IX 型 1 株(1.0%)，未檢出IV 型、VII 型、VIII 型。

2.3 不良妊娠結(jié)局與血清型關(guān)系 見表2。選取的94 例孕婦，出現(xiàn)早產(chǎn)、胎膜早破、宮內(nèi)感染、胎兒宮內(nèi)窘迫和死胎等并發(fā)癥。

3 討論

B 族鏈球菌為人畜共患菌, 早在1887 年報(bào)道主要感染奶牛, 引起奶牛乳腺炎而致牛產(chǎn)奶量降低，因此又稱為無乳鏈球菌。Fry 于1938 年首次報(bào)道了3 例死于B 族鏈球菌產(chǎn)后心內(nèi)膜炎病例,從而認(rèn)識到 GBS 可感染人類[8]。直到 20 世紀(jì) 70 年代,研究發(fā)現(xiàn)GBS 成為美國新生兒死亡的首要原因，才引起社會的廣泛關(guān)注。我國近幾年報(bào)道的GBS導(dǎo)致母嬰疾病病例增多,大量的研究也因此逐步開展。

GBS 呈全球分布,不同地區(qū)孕婦定植情況存在差異，最新的一篇文獻(xiàn)[9]對85 個國家299924 例孕婦GBS 攜帶情況進(jìn)行了分析, 共分離獲得16882株GBS 并分析了血清型，發(fā)現(xiàn)全球孕婦GBS 平均定植率為18%，變化差異為11%~35%，亞洲地區(qū)最低，非洲地區(qū)最高。我國的孕晚期婦女GBS 定值率3.5%~32.4%[10]。III 型是最主要的血清型，血清型 Ia、Ib、II、III 和 V 型 在 所 有 地 區(qū) 孕 婦 定 植 的GBS 中占98%,而VI-IX 血清型主要分離自亞洲地區(qū)，其他地區(qū)少見。

圖1 部分菌株血清型PCR電泳圖

表1 GBS血清分型參照表（血清型別與相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物大小）

表2 血清型與妊娠并發(fā)癥

GBS 臨床檢測方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫層析法、普通PCR、實(shí)時熒光定量PCR、顯色平板法以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法等，各種方法的靈敏度和特異性有差異，但傳統(tǒng)培養(yǎng)法特異性高，實(shí)時熒光定量PCR 靈敏度和特異性都較好, 所以是目前臨床使用最多的兩種檢測方法。

為預(yù)防GBS 感染，西方大多數(shù)國家采用美國2010 年 CDC 推薦方案[11]，即對 35~37 周孕婦常規(guī)篩選，陽性孕婦在分娩前24h 進(jìn)行抗生素預(yù)防性治療，以降低母嬰感染機(jī)會。但是藥物的耐藥性和對新生兒的不良影響是值得關(guān)注的。所以最好的預(yù)防措施是研發(fā)GBS 預(yù)防疫苗，常選用CPS 作為抗原并耦聯(lián)蛋白增加免疫原性。因CPS 具有10 個血清型，且不同地區(qū)的型別有所差異，所以查明當(dāng)?shù)氐难逍涂梢詾槎鄡r疫苗研發(fā)提供理論支持。常規(guī)血清分型方法是兔抗血清分型，但該試劑昂貴，存在交叉反應(yīng)和未定型血清型等缺點(diǎn)，現(xiàn)在多重PCR 技術(shù)能很好的替代該方法，在常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)室可以開展，方便大樣本量GBS 血清型流行性調(diào)查。

本研究分離的菌株來源于10145 例住院孕婦生殖道標(biāo)本，培養(yǎng)為常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法，可能低估了當(dāng)?shù)卦袐DGBS 攜帶率(1.47%)。選取的94 株GBS成功分出7 種血清型，主要以Ib 型33 株(35.1%)和 III 型 25 株 (26.6%) 為主, 其次是 Ia 型 22 株(23.4%);廣東[12]地區(qū)以 III 型（74%）、Ib 型（18%）為主；北京[13]地區(qū)主要血清型有Ⅲ型(41.7%)，Ia 型(13.5%)，V 型(18.8%)。在西澳大利亞[14]孕婦攜帶的GBS 血清型主要是 Ia(27.9%)，III(20.9%)，II(16.3%);韓國[15]孕婦攜帶的血清型以III 型（26.3%）主要，其次是血清型 Ib（21.1%），V（15.8%）。表明江西中部地區(qū)與其他地區(qū)型別有一定差異，值得一提的是，表2 結(jié)果顯示7 種血清型中, 妊娠感染GBS 并發(fā)早產(chǎn)以III 型和Ia 型為主, 胎膜早破以Ia 型和Ib型為主，最常見的感染并發(fā)癥是胎膜早破，甚至還有死胎情況。

本研究發(fā)現(xiàn), 不同地區(qū)孕婦攜帶GBS 情況差異較大。本地區(qū)血清型以Ib 型和III 型為主，妊娠并發(fā)癥與血清型別存在一定關(guān)聯(lián)性。規(guī)范檢測方法，加大篩查力度，仍然是目前預(yù)防GBS 感染孕婦和新生兒最好的措施。