盧濤，牛玉玲

（開封市婦幼保健院婦科，河南 開封 475000）

早產是一種全球性流行病。近年來發(fā)現，早產可導致每年超過一百萬嬰兒的死亡[1]，也是五歲以下兒童死亡的主要原因[2]。早產有多種病因，但在多達50%的早產病例中，感染被認為是一種潛在的致病機制[3]。其中，生殖道感染引起的炎癥可能是導致早產的重要原因[2]。孕期陰道菌群紊亂與早產也有一定的相關性[3,4]。宮頸液內炎癥因子及菌群水平與婦女早產是否有一定的關系，目前研究尚不充足。本研究主要探究宮頸液內炎癥因子及菌群水平與婦女早產的相關性，為預防孕婦早產提供理論依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取 2017 年 10 月-2019 年 10 月我院收治的年齡20～40 歲早產孕婦（孕周＜37 周+0天）和足月孕婦各50 例。孕婦需滿足：⑴單胎妊娠，自然受孕；⑵采集樣本前3 天內無性生活；⑶無其他合并癥，如心臟病，糖尿病，前置胎盤等；⑷無子宮或胎兒異常；⑸無活動性陰道感染；⑹過去2 周內未使用抗生素治療或抗炎治療；⑺取得孕婦及其家屬知情同意。

1.3 樣本采集 孕婦分娩42d 后，通過無菌窺陰器暴露宮頸，用無菌宮頸拭子采集宮頸分泌物。收集宮頸拭子，用10 ml 無菌鹽水注入宮頸后穹窿進行灌洗，收集灌洗液進行宮頸炎性標記物分析。宮頸拭子儲存于-80℃，用于后續(xù)微生物檢測。宮頸灌洗液離心取上清液保存在-80℃，用于炎癥因子的檢測。

1.4 宮頸液微生物組分析 宮頸微生物組分析由南京金唯智生物科技公司完成。使用蛋白珠法從宮頸拭子中提取總基因組DNA，以 20-30ng DNA為模板，使用金唯智設計的一系列 PCR 引物擴增原核生物 16S rDNA 上包括 V3 及 V4 的 2 個高度可變區(qū)。另外，通過 PCR 向16S rDNA 的 PCR產物末端加上帶有 Index 的接頭，以便進行NGS測 序 。通 過 Qubit3.0 Fluorometer (Invitrogen,Carlsbad, CA)檢測文庫濃度。雙端測序得到的正反向reads 首先進行兩兩組裝連接，過濾拼接結果中含有N 的序列，保留序列長度大于200bp 的序列。經過質量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于 OTU 分析，使用 VSEARCH（1.9.6）進行序列聚類（序列相似性設為 97%），比對的16S rRNA 參考數據庫是 Silva 132。然后用 RDP classifier (Ribosomal Database Program) 貝葉斯算法對 OTU 的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。

1.5 宮頸灌洗液炎癥因子分析 采用Luminex 多重分析檢測宮頸灌洗中炎癥因子的濃度。使用10 種分析物多重測定板 （Milliplex MAP 人細胞因子/趨化因子磁珠多重測定板，HCYTOMAG-60K-10，上海益啟生物科技有限公司），按照制造商建議的方案一式兩份地測定灌洗液中的細胞因子和趨化因子濃度，并使用Bio-Plex 讀取數據。使用Bio-Plex Manager 軟件（Bio-Rad）分析數據。

1.6 統(tǒng)計學分析 對采集的數據使用SPSS 19.0 進行數據分析，連續(xù)變量采用均數±標準誤（mean ±SD）表示，分類變量采用中位數和四分位數表示。兩組之間比較采用t 檢驗，宮頸液內炎癥因子及菌群水平與婦女早產之間的關系采用Spearman 秩相關檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 早產組和足月組孕婦一般情況的比較 早產組和足月組孕婦年齡，體重指數（BMI），早產史,懷孕次數,產檢次數差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 早產組和足月組孕婦的一般情況

2.2 早產組和足月組孕婦宮頸液中菌群相對表達量的比較 研究表明，Chao1 指數和Shannon 指數是評價菌群多樣性的指標[5]，Chao1 指數是一種未加權測量微生物多樣性的方法，反應不同微生物數量。Shannon 指數是一種加權測量微生物多樣性的方法，反應微生物的數量和比例。與足月組相比，早產組Chao1 指數和Shannon 指數明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明早產與宮頸中菌群紊亂具有明顯的相關性。見表2。

表2 早產組和足月組孕婦宮頸液中菌群多樣性的比較

2.3 早產組和足月組孕婦宮頸-陰道灌洗液中炎癥因子水平的比較 早產組宮頸灌洗液中IL1-β、IL-6、 和 IL-8 較足月組孕婦明顯升高 （P＜0.001），而TNF-α 和 MCP-1 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明早產與宮頸液中炎癥因子的增加具有相關性。見表3。

表3 早產組和足月組孕婦宮頸- 陰道灌洗液中炎癥因子水平

2.4 早孕組宮頸液炎癥因子與宮頸-陰道液中菌群多樣性的比較關系 早產組炎癥因子IL1-β 與Chao1 指數的相關系數 r=0.718，P＜0.001，IL-8 與Chao1 指 數 的 相 關 系 數 r=0.7180.474，P=0.019，IL1-β 與 Shannon 指數的相關系 數 r=0.623，P=0.032，IL-8 與 Shannon 指數 r=0.554，P=0.045，具有正相關性，表明宮頸灌洗液炎癥因子IL1-β 和IL-8 與宮頸液中菌群紊亂有關。而 IL-6、TNF-α和 MCP-1 與 Chao1 指數和 Shannon 指數無相關性（P＞0.05）。見表4，表5。

表4 早產組孕婦Chao1 指數和炎癥因子的關系

表5 早產組孕婦Shannon指數和炎癥因子的關系

3 討論

孕婦早產是導致圍產期新生兒死亡和疾病的重要原因。正常女性懷孕期間，子宮頸是機體抵抗細菌和病原菌的功能屏障和物理屏障,可保護子宮和胎兒免受來自于陰道上行性感染[6]。宮頸液成分的改變可能對早產、HPV 感染以及宮頸癌變等疾病有一定的預測作用[7,8]。健康女性生殖道的菌群相對簡單，主要是乳酸桿菌屬，乳酸桿菌比例下降可導致生殖道微生態(tài)失衡。研究發(fā)現，陰道厭氧菌的增多與不良妊娠反應有關[9]。細菌性陰道炎、真菌性陰道炎和宮頸上皮內瘤變的女性,陰道菌群改變[4,10,11]，且早產和晚期流產的風險也是正常女性的2倍和6 倍[4]。本研究發(fā)現，與足月產孕婦相比，早產孕婦宮頸液中菌群的多樣性明顯改變,表明宮頸液中微生物的多樣性與早產具有明顯的相關性。

研究表明，宮頸液中菌群的改變可增加宮頸IL-4、IL-6 和 TGF-β1 等炎癥因子的表達[12,13]。而宮頸炎癥的增加與不良妊娠的發(fā)生有關[14,15]。宮頸液中IL-6 的增加與胎膜早破有關[16]。本研究發(fā)現與足月組孕婦相比，早產組孕婦宮頸液中IL1-β、IL-6、和IL-8 的表達明顯升高，表明宮頸液中炎癥因子 IL1-β、IL-6、 和 IL-8 與早產具有明顯的相關性，進一步比較宮頸液中炎癥因子和菌群多樣性發(fā)現IL1-β 和IL-8 表達與宮頸液菌群Chao1 指數和Shannon 指數具有一定的相關性。

綜上所述,宮頸液內炎癥因子及菌群水平與孕婦早產存在相關性,通過干預宮頸液炎癥因子或者菌群可能為防止孕婦早產提供一定的手段。