蔡曉磊，熊麗麗，梁靜

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.婦科，2.病理科；河南 洛陽 471000）

全球每年新增宮頸癌患者約80%的自發(fā)展中國家，對(duì)女性生命健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，該病病因與人乳頭狀瘤病毒 （Human papilloma virus，HPV）感染、早婚、早育、多產(chǎn)等多種因素相關(guān)，臨床主要以放化療輔助根治性手術(shù)為主要治療手段，5 年生存率較高[1-3]。miRNA 調(diào)控人類30%的人類基因，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可以在體液中被檢測(cè)到，有潛力成為疾病治療的靶點(diǎn)[4-6]。有研究[7-9]指出，miR-365 通過抑制細(xì)胞增殖參與腫瘤發(fā)生；miR-135a-5p 在頭頸癌中靶向作用于HOXA10，通過降低其活性來抑制腫瘤增殖；STAT3 屬于癌基因的一種，與腫瘤細(xì)胞增殖、 轉(zhuǎn)移等過程聯(lián)系緊密。但三者在宮頸癌中的作用尚未明確，本研究宮頸癌組織中測(cè)定 miR-365、STAT3、miR-135a-5p表達(dá)，評(píng)估三者與臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，希望為患者治療方案的選擇、 宮頸癌的發(fā)展機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2016 年 6 月-2018 年 7 月在醫(yī)院行宮頸癌手術(shù)切除的存檔蠟塊和癌旁正常組織（距病變部位＞5cm 處，且證實(shí)為無癌浸潤）石蠟標(biāo)本各90 例作為研究對(duì)象。癌組織和癌旁正常組織全部取樣于女性,年齡 42～72 歲,平均 56.64±6.09歲；FIGO 分期：I 期 5 例，II 期 39 例，Ⅲ期 33 例，Ⅳ期 13 例；病理類型：鱗癌 78 例，腺癌 12 例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)確診為宮頸癌，可以明確腫瘤大小、部位、浸潤程度；⑵無放化療治療史；⑶本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者及其家屬對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴孕婦；⑵合并其他惡性腫瘤；⑶患有血液系統(tǒng)疾病或傳染病等； ⑷伴隨肺間質(zhì)疾病或嚴(yán)重肝腎功能障礙；⑸生存期＜3 個(gè)月。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 免疫組化 取4μm 厚石蠟組織切片行常規(guī)HE 復(fù)染，經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，行抗原熱修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再行封閉非特異性結(jié)合，每張切片滴加 100μl 鼠抗人 STAT3（1:100）單克隆抗體（由美國Santa Cruz 公司提供），將切片置于室溫下孵育1h，隨后在每張切片上滴加100μL 新鮮配制的DAB 顯色溶液 （加拿大Ferrmentas 公司提供），于多功能顯微鏡（上海茸研儀器有限公司）下觀察顯色情況，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，已知的STAT3 陽性標(biāo)本為陽性對(duì)照。判定標(biāo)準(zhǔn)[10]：觀察高倍 （×400） 視野下陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度，陽性細(xì)胞占比≤5%為0 分、占比為6%~25%計(jì)1 分、 占比 26%~50%計(jì) 2 分、 占比 51%~75%計(jì) 3分、占比≥76%計(jì)4 分；細(xì)胞未染色計(jì)0 分、淡黃色為1 分、棕黃為2 分、棕褐為3 分，總分=細(xì)胞染色評(píng)分×細(xì)胞占比評(píng)分，總分≥3 分即為陽性表達(dá)。結(jié)果評(píng)判由2 人進(jìn)行雙盲讀片確定。

1.3.2 qPCR 檢測(cè) 收集全部研究對(duì)象存檔蠟塊中的宮頸組織100mg, 在液氮保護(hù)下研磨, 與1ml TRIzoI、200μl 氯仿混合后進(jìn)行離心，通常 RNA 分布于上層無色水相中； 取上層液進(jìn)行RNA 沉淀，管底出現(xiàn)白色沉淀，將獲得的白色沉淀進(jìn)行洗滌和溶解，DU800 型分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度及純度；隨即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃的冰箱中。實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng) （Real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR） 技術(shù)檢測(cè) miR-365、miR-135a-5p 水平，PCR 引物合成由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司提供，PCR 引物序列 miR-365、miR-135a-5p 分別 為 ：5' -CGTAATGCCCCTAAAAAT -3'；5' -ACACTCCAGCTGGGGTGCATTGTAGTTGCA-3'。內(nèi)參照基因?yàn)閁6 RNA。嚴(yán)格按照Access RT-PCR System 試劑盒說明書進(jìn)行操作。由SDS 軟件計(jì)算每個(gè)樣品和內(nèi)參的Ct 值，△Ct=Ct 目標(biāo)基因-Ct 內(nèi)參基因，受試者 miRNA 的相對(duì)表達(dá)水平=2-△△Ct。

1.4 觀察指標(biāo) ⑴miR-365、miR-135a-5p 及STAT3 在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)；⑵收集90 例宮頸癌患者臨床資料,包括年齡、腫瘤分化程度、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、腫瘤直徑及類別情況，分析 miR-365、miR-135a-5p 及STAT3 表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系；⑶miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 的相關(guān)性分析；⑷對(duì)90 例宮頸癌患者通過電話或門診的形式隨訪2 年，末次隨訪時(shí)間為2020 年7 月，統(tǒng)計(jì)患者2年生存情況，ROC 曲線分析miR-365、miR-135a-5p 及STAT3 表達(dá)對(duì)宮頸癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用 χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用（±s）表示，采用 t 檢驗(yàn)，采用 Pearson 相關(guān)性分析研究 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 之間的相關(guān)性，采用受試者工作曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC）評(píng)估各指標(biāo)對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá) miR-365 在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，miR-135a-5p的相對(duì)表達(dá)量、STAT3 的陽性表達(dá)率均高于癌旁組織（P＜0.05），見表1。

2.2 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 FIGO 分期Ⅲ~Ⅳ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化、直徑≥5cm 的宮頸癌組織中miR-365 相對(duì)表達(dá)量分別高于FIGO 分期I~II期、未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、直徑＜5cm 的宮頸癌組織（P＜0.05）；FIGO 分期Ⅲ~Ⅳ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中miR-135a-5p 相對(duì)表達(dá)量分別高于FIGO 分期I~II 期、未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織（P＜0.05）。但不同年齡、腫瘤類型、浸潤深度的宮頸癌組織中 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 的相關(guān)性分析 宮頸癌組織中miR-135a-5p 的表達(dá)與STAT3呈顯著正相關(guān)(r=0.388，P=0.000)，miR-365 與 miR-135a-5p、STAT3 無顯著相關(guān)性（P＞0.05），見表3。

2.4 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 90 例宮頸癌患者2 年總生存率為66.67%（60/90），生存組患者宮頸癌組織中miR-365 的相對(duì)表達(dá)量高于死亡組；miR-135a-5p相對(duì)表達(dá)量低于死亡組（P＜0.05）。ROC 曲線分析顯示 miR-365、miR-135a-5p 及 STAT3 的曲線下面積（Area under curve，AUC）分別為 0.855、0.735、0.549，選取 miR-365、miR-135a-5p 最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為 0.70、8.98，miR-365、miR-135a-5p 對(duì)宮頸癌患者預(yù)后情況有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值,見表4、表5、圖1。

表1 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 在宮頸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

表2 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

表3 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 的相關(guān)性分析

表4 生存組和死亡組患者宮頸癌組織miR-365、miR-135a-5p及 STAT3 表達(dá)

表5 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖1 miR-365、miR-135a-5p及STAT3 預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

宮頸癌是一種發(fā)病率居第二位、 死亡率居首的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來發(fā)病呈年輕化，約有30%的患者在接受治療后仍出現(xiàn)病情惡化[11]。mi-RNA 是一類非編碼單鏈小分子，參與多種疾病過程，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答等多種過程，存在于易提取的外周血循環(huán)系統(tǒng)中，對(duì)于疾病的無創(chuàng)診斷、評(píng)估患者預(yù)后的應(yīng)用中有很大潛力[12]。

miR-135a-5p 多作為抑癌基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖[13]，本研究中，miR-135a-5p 在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織,且與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期密切相關(guān)，以上結(jié)果提示miR-135a-5p 參與了宮頸癌的發(fā)展過程。既往研究[14]在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)STAT3 呈高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO 分期、浸潤深度等病理特征相關(guān)，這與本研究結(jié)論不一致，本研究中，STAT3 在90%的宮頸癌組織中呈陽性表達(dá)，與年齡、FIGO 分期、浸潤深度等各項(xiàng)病理參數(shù)均無相關(guān)性，考慮原因：研究中的樣本容量不同、檢測(cè)手法不同，均會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。通過相關(guān)性分析，本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中miR-135a-5p 的表達(dá)與STAT3 呈顯著正相關(guān)，與既往研究[15,16]一致，提示miR-135a-5p 是一個(gè)有潛力的宮頸癌治療靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，對(duì)STAT3 及其下游信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及增殖過程。

miR-365 在胃癌、宮頸癌等腫瘤中起到抑癌作用,有作為新型治療靶點(diǎn)及分子標(biāo)志物的潛力[17],本研究在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-365 的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，同時(shí)與宮頸癌的FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、分化程度密切相關(guān)，提示miR-365 與宮頸癌的增殖、轉(zhuǎn)移過程相關(guān)。研究[18]通過對(duì)宮頸癌組織中miR-365、E74 樣受體(ELF4)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-365 可以負(fù)靶向調(diào)節(jié)ELF4，通過解除ELF4 的抑制作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，二者與腫瘤大小、分化程度、FIGO 分期均密切相關(guān)。同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)，miR-365、miR-135a-5p 的相對(duì)表達(dá)量與宮頸癌患者短期預(yù)后有相關(guān)性，提示二者對(duì)宮頸癌患者的預(yù)后情況有一定的預(yù)判價(jià)值；但STAT3 的陽性表達(dá)率對(duì)宮頸癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值不大，這可能是因?yàn)楸狙芯恐?0%的宮頸癌組織均呈STAT3 陽性表達(dá)。本研究為回顧性研究，難以避免選例偏倚，有待繼續(xù)擴(kuò)大樣本容量，進(jìn)行前瞻性、隨機(jī)性研究，探究三者在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。

綜上所述，miR-365、miR-135a-5p、STAT3 在宮頸癌組織中的異常表達(dá)，miR-365、miR-135a-5p與腫瘤臨床病理學(xué)指標(biāo)密切相關(guān)，其中miR-135a-5p 的表達(dá)與STAT3 具有顯著相關(guān)性,由此推測(cè)，三者與宮頸癌的發(fā)生過程相關(guān)，miR-365、miR-135a-5p 可以用于評(píng)估患者預(yù)后情況。