馬兵， 范振亞， 王杏， 李晨穎， 朱長(zhǎng)進(jìn)

(北京理工大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，北京 102488)

糖尿病是由多種致病因子引起的代謝紊亂綜合征[1]. 多元醇通路機(jī)理是最早提出的、被公認(rèn)為最具有說(shuō)服力的糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制. 在高血糖情況下(>7 mmol/L)，約占葡萄糖代謝總量1/3的葡萄糖通過(guò)多元醇通路進(jìn)行代謝[2-3]. 葡萄糖多元醇代謝通路的第一步需要醛糖還原酶以及輔酶磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的催化[4-5]. 醛糖還原酶抑制劑可以抑制ALR2的活性，是一類很具有研究意義的藥物[6].

喹喔啉酮具有抗血栓、消炎等多種生物活性，是藥物化學(xué)中的一種十分重要的結(jié)構(gòu)[7-8],前期研究發(fā)現(xiàn)喹喔啉酮衍生物表現(xiàn)出了一定的醛糖還原酶抑制活性[9-11]. 本文以喹喔啉酮為母核，通過(guò)側(cè)鏈設(shè)計(jì)，合成了一系列羧酸類醛糖還原酶抑制劑，研究側(cè)鏈長(zhǎng)度和醛糖還原酶抑制活性之間的構(gòu)效關(guān)系.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

熔點(diǎn)儀：X-4 型顯微熔點(diǎn)儀；核磁共振儀：Bruker Ascend 400M；高分辨質(zhì)譜儀：AGILENT LC/MS ；紫外/可見(jiàn)雙光束分光光度計(jì)：Unico 4802S；高效液相色譜儀：Hitachi D-2000.

1.2 化學(xué)合成

1.2.1 2-(3-氯-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(2)的合成

將2.168 g (12 mmol)3-氯-喹喔啉-2(1H)-酮，4.97 g(36 mmol)K2CO3，1.32 mL(14 mmol)溴乙酸甲酯以及30 mL乙腈放入250 mL燒瓶中，在65 ℃加熱攪拌，TLC監(jiān)測(cè)原料點(diǎn)消失. 待反應(yīng)液冷卻后，抽濾，減壓旋干，將所得固體進(jìn)行柱層析(PE:EA=3:1)，得到目標(biāo)化合物2. 白色固體，產(chǎn)率83%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.84(d,2H),7.67(d,J=6.4 Hz,1H),7.56(d,J=8.4 Hz,1H),5.23(s,2H),3.82(s,3H).

1.2.2 (3-(3-苯丙烯基/4-苯丁烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3a-d)的合成

將2-(3-氯-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯2(1.008 g，4 mmol)，醋酸鈀(0.046 g，0.20 mmol)和三鄰甲基苯基膦(0.086 g，0.28 mmol)加入到裝有20 mL DMF的燒瓶中，在氬氣保護(hù)下，室溫?cái)嚢?0 min，然后加入3-苯丙烯/4-苯丁烯(6 mmol)和Et3N(12 mL)，保持氬氣環(huán)境，反應(yīng)混合物在100 ℃下攪拌12 h. 反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入分液漏斗，加入20 mL的水并用乙酸乙酯萃取，將萃取液用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾除去干燥劑并將濾液減壓旋干，將所得固體進(jìn)行柱層析(PE:EA=3:1)，得到目標(biāo)化合物(3a-c).

2-(3-(3-苯丙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3a)：黃色固體，產(chǎn)率42.6%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ8.51(d,J=7.7 Hz,1H),8.12-7.80(m,3H),7.78-7.56(m,3H),7.45(d,J=7.7 Hz,2H),6.98(d,J=6.4 Hz,1H),5.14(s,2H),5.02(d,J=7.3 Hz,1H),3.70(s,3H),3.38(s,2H).

2-(3-(4-苯丁烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3b)：棕黃色固體，產(chǎn)率27%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,J=8.4 Hz 1H),7.55(dd,J=7.3 Hz,6.2 Hz,2H),7.37-7.14(m,6H),6.96(d,J=8.6 Hz,1H),5.12(s,2H),4.26(d,J=6.9 Hz,1H),3.71(s,3H),2.94-2.73(m,2H),2.75-2.53(m,2H).

2-(3-(3-(4-甲氧基苯基)丙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3c)：棕色固體，產(chǎn)率38.6%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ8.39(d,J=8.6 Hz,1H),8.16-7.94(m,3H),7.80-7.24(m,4H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),5.37(s,2H),3.94(s,3H),3.87(s,2H),3.63(s,3H).

2-(3-(3-(4-羥基苯基)丙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3d)：紅棕色固體，產(chǎn)率41%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ10.37(s,1H),8.39(t,J=8.6 Hz,1H),8.16-7.77(m,3H),7.80-7.24(m,4H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),5.37(s,2H),3.94(s,3H),3.87(s,2H).

1.2.3 2-(3-(3-苯丙基/4-苯丁基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯5的合成

將1 mmol化合物3a/3b和10 mL THF加入到100 mL兩口燒瓶中，再加入10 mL甲醇以及0.36 g 10% Pd/C，在氫氣環(huán)境下室溫反應(yīng)12 h，TLC監(jiān)測(cè)至原料點(diǎn)消失，真空泵抽濾除去Pd/C催化劑，減壓旋干，將產(chǎn)物柱層析提純(PE∶EA=5∶1)，得到目標(biāo)化合物5.

2-(3-(3-苯丙基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(5a):黃色固體，產(chǎn)率52.6%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.85(d,J=8.5 Hz,2H),7.59-7.05(m,5H),6.85(d,J=7.8 Hz,1H),6.75(d,J=7.5 Hz,1H),5.19(s,2H),3.73(s,3H),2.61(t,J=3.5 Hz,2H),1.53(t,J=3.8 Hz,2H),1.48(t,J=3.6 Hz,2H).

2-(3-(4-苯丁基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(5b):棕色固體，產(chǎn)率43.7%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ8.75(d,J=7.4 Hz,2H),7.89-7.65(m,5H),7.42(d,J=6.4 Hz,1H),7.14(d,J=7.5 Hz,1H),5.19(s,2H),3.73(s,3H),1.77(t,J=4.2 Hz,2H),1.53(t,J=4.8 Hz,2H),1.48(t,J=5.3 Hz,2H),1.41(t,J=4.6 Hz,2H).

1.2.4 目標(biāo)化合物(4a-d，6a-b)的合成

將1 mmol 化合物(3a-d,5a-b)，飽和LiOH溶液加入10 mL四氫呋喃溶液中，在室溫下攪拌至TLC監(jiān)測(cè)原料點(diǎn)消失. 反應(yīng)結(jié)束后，滴加10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH為2～3，此時(shí)析出固體，然后分多次萃取(乙酸乙酯)，合并有機(jī)萃取液. 以無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾并減壓除去溶劑，得到目標(biāo)化合物(3a-d,5a-b).

2-(3-(3-苯丙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(4a):黃色固體，產(chǎn)率83%，純度97.59%，熔點(diǎn)263-266 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,1H),8.51-8.24(m,1H),8.12-7.80(m,3H),7.78-7.56(m,3H),7.56 -7.45(m,2H),6.98(d,J=7.7 Hz,1H),5.14(d,J=7.6 Hz,1H),5.02(s,2H),3.38(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ168.82,154.12,151.56,141.93,139.82,132.58,130.76,129.61,129.24,129.11,128.53,124.06,116.59,114.58,43.86,36.92. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+321.1234,found 321.1394.

2-(3-(4-苯丁烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(4b):棕黃色固體，產(chǎn)率87.5%，純度96.53%，熔點(diǎn)240-243 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ11.86(s,1H),7.91(d,J=7.4 Hz,1H),7.55(dt,J=6.5,4.3 Hz,2H),7.37-7.14(m,6H),6.96(d,J=6.3 Hz,1H),5.12(s,2H),4.26(d,J=6.9 Hz,1H),2.94(s,2H),2.68(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ168.76,154.21,151.44,141.98,139.21,133.42,132.08,129.72,129.21,129.03,125.92,123.95,115.84,114.72,43.84,36.10,34.63. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+334.1391,found 335.1396.

3-(3-(3-(4-甲氧基苯基)丙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(4c):棕黃色固體，產(chǎn)率76.4%，純度98.37%，熔點(diǎn)264-266 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.03(s,1H),8.39(t,J=7.2 Hz,1H),8.16-7.77(m,3H),7.80- 7.24(m,4H),6.98(d,J=6.7 Hz,2H),5.37(s,2H),3.94(s,3H),3.87(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ168.45,159.52,157.83,154.32,133.82,133.50,133.31,132.64,130.45,129.82,123.80,115.22,114.38,55.41,44.32,37.14. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+351.1340,found 351.1347.

2-(3-(3-(4-羥基苯基)丙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(4d):深紅棕色固體，產(chǎn)率73%，純度96.86%，熔點(diǎn)285-287 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.10(s,1H),10.37(s,1H),8.39(d,J=7.2 Hz,1H),8.16-7.77(m,3H),7.80-7.24(m,4H),6.78(d,J=6.4 Hz,2H),5.37(s,2H),3.87(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ168.64,155.52,154.10,151.63,139.90,134.08,132.66,132.21,129.73,129.11,123.72,118.23,115.87,114.31,43.65,36.83. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+337.1183,found 337.1406.

2-(3-(3-苯丙基))-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(6a):黃色固體，產(chǎn)率78.9%，純度98.15%，熔點(diǎn)196-198 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.02(s,1H),7.85(d,J=8.5 Hz,2H),7.59-7.05(m,5H),6.85(d,J=7.8 Hz,1H),6.75(d,J=7.5 Hz,1H),5.19(s,2H),2.61(t,J=3.5 Hz,2H),1.53(t,J=3.8 Hz,2H),1.48(t,J=3.6 Hz,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ159.65,154.28,142.08,133.24,132.21,130.13,129.35,129.16,128.76,126.44,123.72,115.31,53.82,36.38,32.25,24.62. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+323.1391,found 323.1391.

2-(3-(4-苯丁基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(6b):棕黃色固體，產(chǎn)率75%，純度97.74%，熔點(diǎn)190-193℃.1H NMR(400 MHz,DMSOd6)δ9.23(d,J=8.1 Hz,1H),7.79(d,J=7.8 Hz,1H),7.57(t,J=7.6 Hz,1H),7.45(d,J=8.3 Hz,1H),7.36(t,J=7.5 Hz,1H),7.31-7.17(m,5H),4.99(s,2H),2.87(t,J=7.2 Hz,2H),2.64(t,J=7.2 Hz,2H),1.79-1.64(m,4H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ159.38,154.35,142.63,133.10,132.35,129.42,128.97,128.53,128.14,125.86,123.35,115.61,53.71,36.78,31.72,30.43,23.86. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+337.1547,found 337.1560.

1.3 ALR2活性測(cè)試

ALR2提取自大鼠晶狀體. 根據(jù)Kinoshita J[12]和La Motta C[13]的報(bào)道方法制備ALR2，通過(guò)分光光度法測(cè)定340 nm時(shí)NADPH吸收的減少，從而測(cè)定酶的活性. 將0.25 mL的NADPH(0.10 mmol/L)，0.1 mL的酶提取液，0.25 mL的磷酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH=6.2)，0.15 mL的去離子水混合均勻，置于30 °C的水浴中孵育10 min. 最后加入0.25 mL的D,L-甘油醛(10 mmol/L)到上述體系中混勻，形成1 mL的反應(yīng)體系，監(jiān)測(cè)4 min，記錄其吸光度. 通過(guò)向上述反應(yīng)體系中加入5 μL DMSO溶解的化合物測(cè)定其對(duì)ALR2的抑制活性. 大多數(shù)化合物的酶抑制率曲線是由至少三種濃度的抑制活性在20%～80%之間生成的，通過(guò)對(duì)數(shù)線性(劑量)與響應(yīng)曲線的線性最小二乘分析計(jì)算出IC50值(r2> 0.95).

1.4 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

使用Molegro Virtual Docker Version 5.0軟件進(jìn)行分子對(duì)接. 從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的具有結(jié)合人醛糖還原酶抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)(lidorestat，其PDB代碼為1Z3N)用于分子對(duì)接. 去除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的所有溶劑分子以進(jìn)行對(duì)接程序. 目標(biāo)化合物最初被繪制為二維(2D)化學(xué)結(jié)構(gòu)，然后用Chem3D 轉(zhuǎn)化為三維(3D)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行優(yōu)化. Molegro Virtual Docker軟件中有配體的所有結(jié)構(gòu)參數(shù)，例如鍵序，雜化，明確的氫原子和電荷. 為了在蛋白質(zhì)中獲得更好的潛在結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行了可能的結(jié)合腔的檢測(cè)，并且獲得了5個(gè)腔. 選擇陰離子結(jié)合位點(diǎn)周圍的空腔進(jìn)行對(duì)接計(jì)算. 每個(gè)配體獲得5種結(jié)合確認(rèn)，并根據(jù)結(jié)合能(MolDock得分)，氫鍵和所有化合物的構(gòu)象相似性選擇最相關(guān)的一種.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成

喹喔啉酮衍生物的具體合成如圖1所示. 3-氯-喹喔啉-2(1H)-酮(1)的合成依據(jù)前期的研究工作[14]. 化合物1和溴乙酸甲酯在碳酸鉀的作用下發(fā)生N烷基化反應(yīng)得到2-(3-氯-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(2). 化合物2與3-苯丙烯、4-苯丁烯通過(guò)Heck偶聯(lián)反應(yīng)，得到化合物3. 將得到的橋連基團(tuán)為1-丙烯基，1-丁烯基的偶聯(lián)產(chǎn)物的碳碳雙鍵還原得到C3位橋連基團(tuán)為正丙基、正丁基的化合物5. 最終，在堿性條件下水解酯類化合物(3a-d,5a-b)，得到N1位為羧酸的喹喔啉酮衍生物(4a-d,6a-b).

圖1 目標(biāo)化合物合成路線圖

2.2 生物活性評(píng)價(jià)

對(duì)所有合成的最終產(chǎn)物都進(jìn)行了ALR2抑制活性實(shí)驗(yàn)，確定了喹喔啉酮衍生物的醛糖還原酶抑制活性，epalrestat被用作ARIs陽(yáng)性對(duì)照. 結(jié)果如表1所示.

化合物4a-b和7均為喹喔啉酮C3位與芳基側(cè)鏈以碳碳雙鍵作為橋連基團(tuán)，測(cè)試結(jié)果表明3種化合物的醛糖還原酶的抑制活性順序?yàn)?b>4a>7，抑制活性最好的化合物4b的IC50為207 nmol/L，活性最小的化合物7的IC50為870 nmol/L(表1). 由此可以看出連接臂碳鏈X依次為2、3、4碳原子的化合物都具有明顯的抑制活性. 而且，隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加，抑制活性顯示出遞增的趨勢(shì).

化合物4a-b的C3位1-丙烯基和1-丁烯基橋聯(lián)基團(tuán)的碳碳雙鍵經(jīng)過(guò)還原，形成烷基橋聯(lián)衍生物，如表1所示. 其中，10的活性最強(qiáng)(IC50=143 nmol/L)，高于化合物8，9，6a和6b. 連接臂碳鏈X的長(zhǎng)度分別為4，3，1，0碳原子的4種化合物的抑制活性順序?yàn)?b>6a>9>8. 其活性順序與上述烯烴橋聯(lián)化合物的構(gòu)效研究結(jié)果相一致，總的趨勢(shì)為碳鏈的延長(zhǎng)對(duì)醛糖還原酶抑制活性明顯增強(qiáng). 烷基橋聯(lián)化合物10的活性優(yōu)于烯烴橋聯(lián)化合物7，但是，6a-b的活性低于雙鍵還原前的4a-b.

在保持喹喔啉酮C3位與芳基以碳碳雙鍵作為橋連基團(tuán)的基礎(chǔ)上，C3位芳基側(cè)鏈的對(duì)位引入甲氧基或酚羥基，分別形成了甲氧基類衍生物和羥基類衍生物. 如表1所示，甲氧基類衍生物11的橋聯(lián)碳原子個(gè)數(shù)為2，其IC50值為246 nmol/L.4c的橋聯(lián)碳原子數(shù)為3，其IC50值為4.181 μmol/L. 此結(jié)果又一次證明了碳鏈的延長(zhǎng)對(duì)醛糖還原酶的抑制活性的增強(qiáng)作用. 羥基類衍生物包括3個(gè)化合物(4d，12和13)，與引入羥基前的對(duì)應(yīng)化合物(4a，8和7)相比，其抑制活性有所提高.同時(shí)，羥基類衍生物4d和12的抑制活性也高于甲氧基類衍生物4c和11. 由此證明酚羥基的引入能夠提高醛糖還原酶的抑制活性. 對(duì)于此類化合物，4d的抑制活性最好(IC50=93 nmol/L)，與目前已上市的epalrestat活性相當(dāng)(IC50=83 nmol/L).13的抑制活性次之，其IC50為182 nmol/L.12的抑制活性最小，其IC50為2.592 μmol/L. 再次證明了醛糖還原酶的抑制活性是隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加逐漸增強(qiáng).

因此，醛糖還原酶抑制活性的測(cè)試結(jié)果充分表明，喹喔啉酮母核的C3位與側(cè)鏈的芳環(huán)之間的連接鏈的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，醛糖還原酶抑制活性提升越顯著. 而且，芳環(huán)上酚羥基的引入能夠提高醛糖還原酶的抑制活性.

表1 喹喔啉酮衍生物的ALR2抑制活性

2.3 分子對(duì)接模擬

運(yùn)用分子模擬軟件，研究了化合物4d的分子對(duì)接，以了解該化合物在ALR2抑制中的機(jī)理. 由于4d在結(jié)構(gòu)上與lidorestat相似，因此選取了序號(hào)為1Z3N的PDB文件用于分子對(duì)接，獲得了5個(gè)MolDock得分，分別為-133.81，-127.153，-129.944，-129.126，-128.924. 根據(jù)結(jié)合能，氫鍵和所有化合物的構(gòu)象相似性選擇最相關(guān)的一種，如圖2所示.4d能夠緊密結(jié)合在ALR2的活性位點(diǎn)中，與氨基酸殘基Tyr48(0.326 nm)、Tyr111(0.329 nm)和Thr113(0.304 nm)形成氫鍵作用并與輔因子NADP+的帶正電煙酰胺部分形成穩(wěn)定地靜電相互作用，從而羧基能夠很好地插入陰離子腔. 此外，C2位的羰基結(jié)構(gòu)也能與氨基酸殘基Cys298(0.268 nm)形成氫鍵作用，這也直接影響化合物與酶的結(jié)合. C3位置上的芳環(huán)平面與氨基酸殘基Trp111上的吲哚環(huán)相鄰平行，相互間形成π-π疊加作用. 而且，較長(zhǎng)的側(cè)鏈能夠很好地進(jìn)入到由氨基酸殘基Trp111，Leu300，Phe122，Cys303，Thr113，Phe115以及Trp79所形成的特異性口袋形成疏水相互作用.

分子對(duì)接研究表明目標(biāo)化合物與醛糖還原酶的活性位點(diǎn)結(jié)合緊密. 因此，目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)是合理的.

圖2 化合物4d和ALR2的活性位點(diǎn)對(duì)接

3 結(jié) 論

本文選擇以喹喔啉-2(1H)-酮為母核結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)修飾母核C3位側(cè)鏈的長(zhǎng)度，設(shè)計(jì)合成了一系列喹喔啉酮衍生物作為醛糖還原酶抑制劑，并對(duì)其ALR2的抑制活性進(jìn)行了檢測(cè). 構(gòu)效關(guān)系研究表明，C3位側(cè)鏈的延長(zhǎng)以及側(cè)鏈芳環(huán)酚羥基的引入有利于提高化合物的抑制活性. 其中，化合物4d表現(xiàn)出了較好的抑制活性(IC50=93 nmol/L)，與目前上市的epalrestat活性相當(dāng)(IC50=83 nmol/L). 最后，運(yùn)用分子對(duì)接軟件從分子水平上論證了目標(biāo)化合物設(shè)計(jì)的合理性. 本研究對(duì)進(jìn)一步設(shè)計(jì)強(qiáng)效的醛糖還原酶抑制劑具有重要的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值.