姚麗莉， 許齊純， 劉曉萌， 李鴻鑫，高鑫譽(yù)， 徐梧皓， 呂常江*，4， 曹宏偉

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶163000；2. 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023；3． 南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京210029；4. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

輔酶Q10（Coenzyme Q10，CoQ10）化學(xué)名稱為2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌，廣泛存在于高等動(dòng)物線粒體內(nèi)膜中，是細(xì)胞呼吸鏈中重要的電子受體， 也是合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）所必須的重要輔酶之一[1]。作為天然的抗氧化劑和細(xì)胞代謝激活劑[2]，CoQ10具有抗氧化、抗衰老、清除體內(nèi)自由基、維持細(xì)胞膜通透性及提高機(jī)體免疫力等多種生理功能， 廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)[3-4]。 近年來，CoQ10作為一種輔助藥物，在治療冠心病、急慢性肝炎、阿爾茨海默癥、糖尿病、帕金森癥及弱精子癥等疾病方面使用比例逐年增加[5-7]。因而，實(shí)現(xiàn)CoQ10高效合成具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

CoQ10的制備方法主要有動(dòng)植物組織提取法、植物細(xì)胞培養(yǎng)法、化學(xué)合成法及微生物發(fā)酵法[8]。 相較于前三者，微生物發(fā)酵法具有原材料豐富、成本低、可規(guī)模放大、分離過程相對(duì)簡單、環(huán)境污染物較少、產(chǎn)品活性好、不存在手性問題等優(yōu)點(diǎn)，已成為CoQ10生產(chǎn)的首選途徑[9]。 迄今為止，已有多株產(chǎn)CoQ10菌株被發(fā)掘，分布于假絲酵母、擲孢酵母、隱球酵母、裂殖酵母、煙曲霉、鏈霉菌、黑粉菌、假單胞菌、土壤桿菌、日本葡萄糖酸桿菌、脫氮極毛桿菌、脫氮副球菌、紅極毛桿菌、莢膜紅細(xì)菌、渾球紅細(xì)菌及類球紅細(xì)菌等多個(gè)種屬[10-11]。 其中，類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides） 是一種紫色非硫光合細(xì)菌，可通過循環(huán)光合磷酸化獲取能量（ATP）用于自身生長繁殖[12]。 R. sphaeroides 細(xì)胞內(nèi)需積累較多的CoQ10以消除光合作用產(chǎn)生的大量自由基； 同時(shí)，R. sphaeroides 細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)較發(fā)達(dá)， 在發(fā)酵后期，細(xì)胞膜發(fā)生形變并向內(nèi)褶皺， 為CoQ10提供附著位點(diǎn)[13]，因而成為發(fā)酵制備CoQ10的主要菌種之一。 但野生型R. sphaeroides 的CoQ10產(chǎn)量較低，發(fā)酵生產(chǎn)過程中存在收率偏低和成本較高等問題，制約了產(chǎn)品進(jìn)一步市場化。

近年來，隨著R. sphaeroides 生理代謝機(jī)制研究的深入，其CoQ10合成途徑被逐漸解析，見圖1。 主要涉及3 個(gè)模塊：莽草酸途徑（SKP）、甲基赤蘚糖醇磷酸鹽（MEP）途徑和泛醌（QMP）途徑。 除通過發(fā)酵調(diào)控策略[14-15]提升CoQ10產(chǎn)率外，利用誘變育種或代謝工程改造獲取高產(chǎn)菌株已成為研究的主要方向。如圖1 所示，4-羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid，pHBA）是CoQ10合成的前體，但其積累對(duì)細(xì)胞有毒害作用。 基于這一現(xiàn)象，扶教龍[16]和柯崇榕[17]等分別通過亞硝基胍（NTG）或紫外線對(duì)R. sphaeroides 進(jìn)行誘變， 并以pHBA、CoQ10結(jié)構(gòu)類似物維生素K3、疊氮化鈉等復(fù)合物作為抗性篩選標(biāo)記，所獲得的高產(chǎn)突變株R.sp3-7 與EIM-4 的CoQ10產(chǎn)量分別達(dá)到93.63 mg/L 和185.71 mg/L，較出發(fā)菌株分別提高了116.8%和29.31%。 UbiG 是QMP 途徑中的關(guān)鍵蛋白，Lu[18]等通過代謝工程手段過表達(dá)該蛋白質(zhì)促使CoQ10產(chǎn)量由47.6 mg/L 提升至65.8 mg/L；而在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步組合優(yōu)化MEP 途徑中DXS、DXR、IDI和IspD 的表達(dá)，使得CoQ10產(chǎn)量提高至93.34 mg/L。類胡蘿卜素與CoQ10合成途徑競爭前體物質(zhì)香葉基香 葉 基 焦 磷 酸 （Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）。Zhu[19]等通過調(diào)控光氧調(diào)控因子ppsR 表達(dá)，適當(dāng)抑制類胡蘿卜素的合成， 促使CoQ10的產(chǎn)量提高了約28%； 而后將GGPP 合成關(guān)鍵酶CrtE 和PpsR 串聯(lián)， 從而解除了PpsR 對(duì)crtE 表達(dá)的抑制，進(jìn)一步提高CoQ10的產(chǎn)量至73.2 mg/L，比野生型提高了47%。

圖1 類球紅細(xì)菌中類胡蘿卜素和CoQ10 的合成途徑Fig. 1 Synthesis pathways of carotenoids and CoQ10 in R. sphaeroides

為獲取CoQ10高產(chǎn)菌株， 作者首先從污水處理廠的淤泥中富集、 分離了15 株產(chǎn)CoQ10光合細(xì)菌。隨后，對(duì)CoQ10產(chǎn)率最高的菌株（YLL-13）進(jìn)行了生理生化特性及16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析。 進(jìn)一步以該菌株為出發(fā)菌株， 采用亞硝基胍進(jìn)行化學(xué)誘變，以維生素K3 和PHBA 為篩選標(biāo)記， 獲取了一株具有低類胡蘿卜素合成、 高生長速率和高CoQ10積累的突變菌株（YLL-13-T），并初步研究了該突變菌株發(fā)酵合成CoQ10的特性。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1）富集培養(yǎng)基（組分g/L）[20]：NaCl 1.5，NaHCO31.0，K2HPO40.2，CH3COONa 3.0，MgSO4·7H2O 0.2，NH4Cl 1.0；生長素輔助因子貯液1 mL，微量金屬元素貯液10 mL，pH 7.0。

生長素輔助因子貯液（組分mg/L）：硫胺素5.0，煙酸10.0，4-氨基苯甲酸15.0，生物素15.0。

微量金屬元素貯液 （組分mg/L）：FeCl3·6H2O 5.0，CuSO4·5H2O 0.05，H3BO31.0，MnCl2·4H2O 0.05，ZnSO4·7H2O 1.0，Co（NO3）2·6H2O 0.5；pH 7.0。

2）種子培養(yǎng)基：葡萄糖3.0 g/L，酵母粉8.0 g/L，玉米漿干粉1.0 g/L，NaCl 2.0 g/L，KH2PO41.3 g/L，MgSO4125 mg/L，F(xiàn)eSO4100 mg/L，MnSO41.0 mg/L，生物素15.0 mg/L，煙酸1.0 mg/L，硫胺素1.0 mg/L，pH 7.2。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40.0 g/L，玉米漿干粉5.5 g/L，谷氨酸鈉3.0 g/L，NaCl 2.0 g/L，CaCl20.1 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO46.3 g/L，（NH4）2SO42.5 g/L，F(xiàn)eSO4100 mg/L，MnSO41.0 mg/L，CoCl220.0 mg/L，生物素15.0 mg/L，煙酸1.0 mg/L，硫胺素1.0 mg/L，pH 7.2。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒：購自生工生物工程（上海） 股份有限公司；PrimerSTAR? Max DNA Polymerase、DNA Marker：購自Takara 公司；硫胺素、生物素、煙酸、pHBA、 亞硝基胍、 維生素K3、CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇、乙醇（色譜純）：購自阿拉丁試劑（上海）有限公司； 谷 氨 酸 鈉、NaOH、（NH4）2SO4、CaCO3、FeSO4、MnSO4、CoCl2、無水乙醇、乙酸乙酯：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米漿干粉：購自上海緣肽生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CoQ10產(chǎn)生菌的篩選 將1 g 采自黑龍江省大慶市林甸縣林甸鎮(zhèn)污水處理廠的底泥樣品溶在100 mL 無菌水中，32 ℃、150 r/min 搖床振蕩孵育30 min。 隨后， 取1 mL 懸液接種于富集培養(yǎng)基中，32 ℃下光照厭氧（1 500 Lx）培養(yǎng)2 d。 取100 μL 上述微紅培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至第二瓶富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)3～4 次后于固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線分離，獲取單菌落。 挑取形態(tài)、大小及顏色差異的菌落，接種至種子培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)4 d，離心收集菌體細(xì)胞并測定CoQ10含量。

1.2.2 生理生化特征實(shí)驗(yàn) 選取CoQ10含量較高的菌株，參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》（第9 版）及東秀珠等編著的 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（第1 版）中相應(yīng)屬、種鑒定的有關(guān)內(nèi)容選擇生理生化試驗(yàn)性狀，包含惟一碳源、氮源、電子供體及生長因子生長試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)，采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)觀察。

1.2.3 菌株16S rDNA 序列分析 取0.5 mL 菌懸液， 離心收獲菌體細(xì)胞并采用細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取基因組DNA， 以細(xì)菌鑒定通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 進(jìn)行序列PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：98 ℃5 min；98 ℃20 s，55 ℃15 s，72 ℃25 s， 進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至哈爾濱中科賽恩斯生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。 測序結(jié)果遞交至GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中， 獲取登錄號(hào)。采用Clustal W 進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA 5.1 軟件的Neighbour Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.4 色素的提取及TLC 指紋圖譜獲取 離心收集好氧培養(yǎng)條件下的菌體細(xì)胞，經(jīng)0.2 mol/L 的PBS（pH 7.2）洗滌3 次后，采用超聲輔助的丙酮-甲醇提取法[23]（甲醇、丙酮-甲醇（體積比7∶2）和丙酮作為提取劑各提取一次）進(jìn)行色素抽提。 超聲波處理?xiàng)l件：功率400 W，超聲3 s，間歇6 s，循環(huán)200 次。 4 ℃、8 000 r/min 離心15 min，收集上清液并合并。 色素粗提液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后采用乙醚溶解并定容，于硅膠G 板上進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為10～20 μL；然后選擇不同極性的展層劑 （石油醚∶正己烷∶異丙醇∶丙酮的體積比為10∶0.95∶0.25∶0.40） 進(jìn)行避光展層，展層結(jié)束后將展層板拍照，獲取色素的TLC 指紋圖譜。

1.2.5 吸收光譜測定及類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析活細(xì)胞吸收光譜測定： 菌體細(xì)胞經(jīng)pH 7.5 的10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗滌2 次， 懸浮于質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的蔗糖溶液中，選用光程為1 cm 的96 孔石英酶標(biāo)板于光吸收酶標(biāo)儀（SPECTRA MAX 190）中進(jìn)行全波長光譜掃描，加樣量為200 μL，掃描波長范圍為190～800 nm。色素吸收光譜測定也采用石英酶標(biāo)板，掃描波長范圍相同。根據(jù)Jessen 公式：C=DVf×10/2 500， 計(jì)算細(xì)胞類胡蘿卜素含量。 式中，C為胡蘿卜素總質(zhì)量（mg）；V 為抽提液總體積（mL）；f為稀釋倍數(shù)；D 為離體類胡蘿卜素最大吸收峰（λ=480 nm）的光密度；2 500 為類胡蘿卜素的平均消光系數(shù)。

1.2.6 菌株誘變方法 取1 mL 原始菌株菌懸液，5 000 r/min 離心5 min 獲取菌體， 生理鹽水離心洗滌兩次， 重懸于質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 亞硝基胍的生理鹽水中，室溫靜置45 min。 5 000 r/min 離心5 min獲取菌體， 生理鹽水重懸后涂布于含有12 mg/L 維生素K3 和0.6 g/L pHBA 的固體平板上，32 ℃靜置培養(yǎng)4～5 d。挑取平板上菌落較大、顏色較淺、菌落粘性相對(duì)較低的突變菌株，于種子培養(yǎng)基中32 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)120 h，HPLC 法測定細(xì)胞中CoQ10產(chǎn)量。

1.2.7 CoQ10發(fā)酵條件 采用10 L 發(fā)酵罐對(duì)出發(fā)菌和突變株進(jìn)行發(fā)酵， 并測定發(fā)酵液中CoQ10的質(zhì)量濃度。 發(fā)酵控制工藝：裝液量為4.5 L，發(fā)酵溫度為32 ℃，通氣比2.0 vvm，初始攪拌速率為500 r/min；48 h 后調(diào)節(jié)攪拌速率至400 r/min， 通氣比0.75 vvm。 發(fā)酵時(shí)長120 h，氨水調(diào)控pH 在7.2 左右。 當(dāng)發(fā)酵體系葡萄糖質(zhì)量濃度低于10 g/L 時(shí)，采用指數(shù)流加補(bǔ)料方式維持葡萄糖在10 g/L。離心收獲菌體，超聲輔助提取CoQ10。

1.2.8 CoQ10的提取 取上述菌懸液于8 000 r/min離心15 min， 所得菌體再用無菌生理鹽水洗滌兩次。取1 mL 發(fā)酵菌懸液，加入200 μL 20 mmol/L 的HCl 并充分混勻，75 ℃條件下水浴15 min，5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入5 mL 提取液（V乙酸乙酯∶V乙醇=5∶3）并充分混勻，而后置于超聲波清洗儀中，超聲輔助（功率400 W）提取15 min，避光抽提10 min。 將抽提液于8 000 r/min 條件下離心15 min，獲得CoQ10提取液。

1.2.9 CoQ10定性及定量分析 CoQ10定性分析采用液相色譜-質(zhì)譜法 （HPLC-MS）。 色譜條件：Hypersil ODS（C18）色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為純甲醇；柱溫40 ℃；檢測波長275 nm；流量0.5 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；離子源為電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式檢測；掃面范圍為100～1 800 m/z；干燥氣流為6 L/min；霧化氣壓20 psi；毛細(xì)管電壓4 000 V。

CoQ10定量分析采用高效液相色譜 （HPLC）法測。 色譜條件：Hypersil ODS（C18）色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為V甲醇∶V異丙醇=3∶1；柱溫40 ℃；檢測波長275 nm；流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)CoQ10 光合細(xì)菌的分離與篩選

振蕩孵育處理的底泥樣品接種于富集培養(yǎng)基中，光照厭氧（1 500 Lx、32 ℃）靜置培養(yǎng)2 d 后傳代培養(yǎng)3～4 次。 選取深紅色的菌懸液，梯度稀釋后涂布固體平板并獲取單菌落。 隨后挑取顏色、形態(tài)與大小差異的15 個(gè)菌落， 于液體試管中活化后進(jìn)行劃線分離，以獲取純菌株。 將上述菌株接種于種子培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)4 d 后離心收集菌體細(xì)胞， 并采用HPLC-MS 及HPLC 法分別對(duì)細(xì)胞中CoQ10進(jìn)行定性及定量分析，見圖2（a）。結(jié)果顯示， 篩選獲取的15 株光合細(xì)菌細(xì)胞中均含有CoQ10， 但其產(chǎn)量差異較大； 其中，13 號(hào) 菌株（YLL-13）CoQ10產(chǎn)量最高，為0.23 g/L，見圖2（b）。因此，選取該菌株為目的菌株，進(jìn)行生理生化特性分析。

圖2 CoQ10 的HPLC-MS/MS 圖譜及各菌株CoQ10 產(chǎn)量分析Fig. 2 HPLC-MS/MS chromatogram of CoQ10 and the CoQ10 concentration of selected strains

2.2 產(chǎn)CoQ10 菌株生理生化特性分析

參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應(yīng)屬、種鑒定的有關(guān)內(nèi)容對(duì)菌株YLL-13 進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。 結(jié)果顯示：該菌株為微好氧菌，菌落圓形凸起、邊緣整齊、表面濕潤有粘性、呈深紅色，能利用蘋果酸、葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、D-半乳糖、D-麥芽糖、蔗糖、乙醇、谷氨酸鹽、甘油及硫代硫酸鈉，不能利用檸檬酸、精氨酸、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-木糖、蜜二糖與鳥氨酸。 該菌株能水解淀粉和液化明膠，接觸酶、氧化酶、磷酸酶及乙醇脫氫酶均為陽性，尿酶陰性，不能還原硝酸鹽，不產(chǎn)H2S，無生長因子，生物素為其生長刺激因子。 菌株YLL-13 的生理生化特征與類球紅細(xì)菌基本一致。

2.3 菌株16S r DNA 序列分析

提取菌株YLL-13 基因組DNA，以細(xì)菌鑒定通用引物對(duì)其16S rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 隨后，將特異性條帶切膠回收、 純化并測序， 結(jié)果上傳至Genbank，獲取登錄號(hào)MN625849.1。 采用Clustal W軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)， 并利用MEGA 5.1 軟件中的Neighbour Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。 系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示， 菌株YLL-13 與R. sphaeroides 2.4.1 及R. sphaeroides ATCC17029 聚為一族， 相似性達(dá)100%。 由此，依據(jù)菌株生理生化及系統(tǒng)進(jìn)化分析，將菌株YLL-13 鑒定為類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides），并命名為R. sphaeroides YLL-13。

圖3 菌株16S r RNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 3 Phylogenetic relationships of the strains drived from 16S r DNA sequences

2.4 化學(xué)誘變選育高產(chǎn)CoQ10 突變株

為進(jìn)一步提升R. sphaeroides YLL-13 的CoQ10合成效率， 選取NTG 為誘變劑、 以維生素K3 和pHBA 為復(fù)合篩選標(biāo)記， 對(duì)菌株YLL-13 進(jìn)行誘變選育。在含有12 mg/L 維生素K3和0.6 g/L pHBA 的平板上，共獲取了約200 余個(gè)單菌落；隨機(jī)挑選10個(gè)直徑較大的菌落接種至種子培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min 下振蕩培養(yǎng)120 h，測定細(xì)胞中CoQ10產(chǎn)量，結(jié)果見圖4。 除M2 與M6 外，其它菌株合成CoQ10的能力較野生型菌株均有所提升；其中，M9 菌株最為明顯，達(dá)到0.47 g/L；且傳代培養(yǎng)15 代后CoQ10產(chǎn)量仍保持在92%左右，表明該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。 此外， 突變株M9 菌落形態(tài)與野生菌株相似，細(xì)胞形態(tài)呈短桿狀，未發(fā)生明顯變化，見圖5。

值得關(guān)注的是， 盡管突變株M9 活細(xì)胞吸收光譜（圖6（a））及色素提取液吸收光譜（圖6（b））均未發(fā)生藍(lán)移或紅移，色素的TLC 指紋圖譜亦相似（圖6（c）），但該突變株液體培養(yǎng)物顏色相對(duì)較淺，呈粉紅色， 且類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.47 mg/g（DCW），較野生菌株降低了36.3%， 表明突變株類胡蘿卜素合成速率發(fā)生明顯改變。 基于此，將該突變株命名為R. sphaeroides YLL-13-T， 并保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1883。

圖4 化學(xué)誘變篩選結(jié)果Fig. 4 Screening results of chemical mutagenesis

圖5 R. sphaeroides YLL-13 及其突變株M9的掃描電鏡圖Fig. 5 Scanning electron microscopy of R. sphaeroides YLL-13 and its mutant M9

2.5 高產(chǎn)突變株批次發(fā)酵產(chǎn)CoQ10 性能分析

將R. sphaeroides YLL-13 和R. sphaeroides YLL-13-T 接種于含有50 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，于32 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h，作為一級(jí)種子液。 隨后，將菌懸液全部轉(zhuǎn)接至含有450 mL種子培養(yǎng)基的1 L 錐形瓶中，32 ℃、200 r/min 下繼續(xù)培養(yǎng)20～22 h，作為二級(jí)種子液。 而后，將上述500 mL 二級(jí)種子液進(jìn)一步轉(zhuǎn)接至10 L 發(fā)酵罐中，裝液量為4.5 L，發(fā)酵溫度為32 ℃，通氣比2.0 vvm，初始攪拌速率為500 r/min；48 h 后調(diào)節(jié)攪拌速率至400 r/min，通氣比0.75 vvm，氨水調(diào)控pH 在7.2 左右；當(dāng)發(fā)酵體系葡萄糖質(zhì)量濃度低于10 g/L 時(shí)，采用指數(shù)流加補(bǔ)料方式維持葡萄糖在10 g/L， 發(fā)酵時(shí)長120 h。

上述條件下，R.sphaeroides YLL-13 與R.sphaeroides YLL-13-T 的細(xì)胞生長及CoQ10合成見圖7。研究顯示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，野生菌YLL-13 和突變株YLL-13-T 生物量逐漸增加，至60 h 左右進(jìn)入平衡期，但突變株呈現(xiàn)出更高的生長速率。 與細(xì)胞生長相類似，YLL-13 和突變株YLL-13-T 細(xì)胞中CoQ10的積累也呈現(xiàn)相似的趨勢。 與之相對(duì)，兩菌株CoQ10產(chǎn)率在對(duì)數(shù)期較為接近， 但當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期（60 h），突變株YLL-13-T 的CoQ10產(chǎn)率則逐漸高于野生菌株。 發(fā)酵結(jié)束時(shí)（120 h）， 突變株YLL-13-T 的生物量、CoQ10產(chǎn)量和CoQ10產(chǎn)率分別為83.5 g/L、1.04 g/L 和12.46 mg/g（DCW），較出發(fā)菌株提高了12.3%、42.5%和23.6%， 呈現(xiàn)出更好的工業(yè)化應(yīng)用前景。 此外，能否通過代謝工程手段對(duì)R. sphaeroides YLL-13-T 的CoQ10生物合成途徑進(jìn)行遺傳修飾或改造以進(jìn)一步提高其CoQ10產(chǎn)量，值得進(jìn)一步探索。

圖6 活細(xì)胞吸收光譜、色素提取液吸收光譜及色素的TLC 指紋圖譜Fig. 6 Absorption spectra of living cells of YLL-13 and its mutant M9，pigment extracts and profile of pigment fingerprints on TLC

圖7 菌株YLL-13 及突變菌株YLL-13-T 批次發(fā)酵產(chǎn)CoQ10 性能分析Fig. 7 Fed-batch fermentation process of CoQ10 produced by wild-type strain YLL-13 and mutant strain YLL-13-T

3 結(jié) 語

從污水處理廠的淤泥中篩選到一株CoQ10高產(chǎn)菌株YLL-13，通過其形態(tài)觀察、生理生化特性分析及16S rDNA 序列比對(duì)，鑒定為類球紅細(xì)菌，并命名為R. sphaeroides YLL-13。 為進(jìn)一步提升該菌株COQ10合成效率，選取NTG 為誘變劑，以維生素K3和pHBA 為復(fù)合篩選標(biāo)記，對(duì)其進(jìn)行誘變選育，并篩選獲取了一株具有相對(duì)低類胡蘿卜素合成、 高生長速率和高CoQ10積累特性且遺傳穩(wěn)定的突變菌株（R. sphaeroides YLL-13-T）。 在所考察的發(fā)酵體系中，發(fā)酵120 h 后突變株YLL-13-T 的CoQ10產(chǎn)量和產(chǎn)率達(dá)到1.04 g/L 和12.46 mg/g（DCW），比出發(fā)菌株分別提高了42.5%和23.6%， 展現(xiàn)出更好的應(yīng)用前景。