旋凱昂， 張榮珍*， 饒俊超， 徐 巖

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

他汀類藥物即3-羥基-3 甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑是目前最暢銷的降脂類藥物，同時(shí)它也是治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、骨質(zhì)疏松癥、抗腫瘤和抗老年癡呆癥等多種疾病的藥物[1-3]。 其中阿托伐他汀鈣（利普妥）因其治療效果好且副作用小，銷量最好[4]。 他汀類藥物的生產(chǎn)可以通過將母體環(huán)部分和側(cè)鏈部分分開合成，然后以適當(dāng)方式鏈接在一起達(dá)到合成的目的，其中側(cè)鏈部分具有相似的結(jié)構(gòu)，可由手性中間體進(jìn)行合成[5-6]。 藥物手性中間體的合成可有多種化學(xué)方法，但通常合成步驟多，且反應(yīng)條件苛刻，環(huán)境污染大。 在開拓藥物合成上，如果能實(shí)現(xiàn)縮短反應(yīng)合成步驟，且使反應(yīng)條件更溫和并減少環(huán)境污染，提供綠色可持續(xù)制備策略，這是研究者們努力研究的方向[7]。

近年來(lái)，在他汀類藥物側(cè)鏈中間體的合成研究中， 利用2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶（DERA，EC 4.1.2.4）結(jié)合化學(xué)氧化法合成他汀類側(cè)鏈中間體的方法最為有效，其反應(yīng)過程步驟最少且原子利用率高[8-12]。 DERA 作為惟一的乙醛依賴型醛縮酶，能夠利用簡(jiǎn)單易獲取的乙醛和氯乙醛作為底物，進(jìn)行連續(xù)兩次羥醛加成反應(yīng)，且不需要輔底物的添加就可催化生成產(chǎn)物（3R，5S）-6-氯-2，4，6-三脫氧吡喃己糖（CTeHP）。在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步通過化學(xué)法被區(qū)域選擇性氧化獲得（3R，5S）-6-氯-2，4，6-三脫氧己內(nèi)酯（CTeHL）。 CTeHL 可作為合成阿托伐他汀側(cè)鏈部分的中間體[13]，反應(yīng)過程見圖1。

關(guān)于DERA 參與反應(yīng)的研究報(bào)道，最早是發(fā)現(xiàn)來(lái)源于大腸桿菌Escherichia coli 的脫氧核糖醛縮酶能夠催化此反應(yīng)過程[14]，但此野生型酶對(duì)醛類底物耐受性差，催化效率低。 近年來(lái)，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)來(lái)自其他微生物的DERA 催化此反應(yīng)的能力[15]，如來(lái)源于Lactobacillus brevis 的DERA[16]。 而涉及立體選擇性氧化中間物CTeHP 形成目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL 的反應(yīng)過程中，通常采用溴滴加氧化或次氯酸鈉和乙酸進(jìn)行選擇性氧化等化學(xué)方法[8，17]。然而利用生物酶法選擇性氧化的報(bào)道較少，目前僅有兩篇相關(guān)報(bào)道。 一個(gè)是來(lái)自大腸桿菌作為膜蛋白表達(dá)的吡咯喹啉醌PQQ 依賴型葡萄糖脫氫酶[18]，另一個(gè)是來(lái)源于Lodderomyces elongisporus 菌的NADP+依賴型醇脫氫酶LeADH[19]。 但是關(guān)于串聯(lián)兩個(gè)反應(yīng)過程，即DERA 催化合成CTeHP 和醇脫氫酶催化合成CTeHL，利用生物偶聯(lián)的方法整合兩個(gè)催化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)一步法催化合成終產(chǎn)物CTeHL 沒有相關(guān)報(bào)道。

圖1 阿托伐他汀側(cè)鏈中間體的合成反應(yīng)過程Fig. 1 Reaction synthesis of atorvastatin side-chain intermediate

通過分別構(gòu)建來(lái)自Streptococcus suis 的脫氧核糖醛縮酶SsDERA 和來(lái)自Lodderomyces elongisporus的醇脫氫酶LeADH 的重組質(zhì)粒， 共轉(zhuǎn)化于一個(gè)大腸桿菌BL21 細(xì)胞中， 生物偶聯(lián)兩個(gè)酶用于催化CTeHL 的合成反應(yīng)。 利用構(gòu)建的重組菌株全細(xì)胞酶串聯(lián)催化反應(yīng)合成路徑，實(shí)現(xiàn)直接從底物到終產(chǎn)物CTeHL 的合成過程，提供了一種綠色無(wú)污染的他汀類側(cè)鏈中間體CTeHL 的“一步”生物合成策略及產(chǎn)物鑒定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及主要試劑 Escherichia coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞：Novagen 公司；蛋白胨和酵母粉：BD 公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖IPTG：寶生物工程（大連）有限公司（Takara）；體積分?jǐn)?shù)40%乙醛與40%氯乙醛水溶液：國(guó)藥集團(tuán)；工業(yè)級(jí)輔酶NADP+：貴州科奧德生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 超聲破碎儀VCX750：購(gòu)自美國(guó)Sonic 公司；蛋白質(zhì)電泳儀：購(gòu)自Bio-Rad 公司；TSQ8000 三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀： 購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司； 全數(shù)字化核磁共振波譜儀：購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：購(gòu)自瑞士步琪公司； 超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號(hào)X500R）：購(gòu)自美國(guó)AB SCIEX 公司。

1.2 目的基因的選取與質(zhì)粒合成

1.2.1 目標(biāo)基因的選取 目標(biāo)基因的序列是通過在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)選取， 并分別確認(rèn)來(lái)自Streptococcus suis 菌株的脫氧核糖醛縮酶的序列 （GenBank ID：WP_002935276.1） 和來(lái)自Lodderomyces elongisporus 菌株的醇脫氫酶（GenBank ID：XP_001527075.1）的序列信息。

1.2.2 密碼子優(yōu)化和基因合成 所找尋的兩種酶的蛋白質(zhì)序列由無(wú)錫天霖生物技術(shù)有限公司合成，并對(duì)序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以適宜在E.coli 宿主菌中表達(dá)。SsDERA 的基因合成到質(zhì)粒載體pET28 上，獲得重組質(zhì)粒pET28-SsDERA，從5′-3′基因序列酶切位點(diǎn)分別為Bam H I 和Xho I；LeADH 的基因合成到質(zhì)粒載體pET21 上， 獲得重組質(zhì)粒pET21-LeADH， 從5′-3′基因序列酶切位點(diǎn)為Bam H I 和Xho I， 其中LeADH 目標(biāo)基因序列的終止密碼子TAA 去除。

1.3 目的菌株的構(gòu)建及蛋白質(zhì)表達(dá)

1.3.1 目的菌株的構(gòu)建 兩重組質(zhì)粒pET28-SsDERA 和pET21-LeADH，分別包含不同的抗性基因，前者是卡那霉素抗性，后者為氨芐霉素抗性。 利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的方法使兩個(gè)重組質(zhì)粒導(dǎo)入同一E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，能在含有卡那與氨芐的雙抗性固體培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)的克隆為帶有兩個(gè)不同重組質(zhì)粒的目的菌株E. coli BL21/pET28-SsDERA/pET21-LeADH。

1.3.2 菌體的培養(yǎng)及蛋白質(zhì)表達(dá) 將重組菌E. coli BL21/pET28-SsDERA/pET21-LeADH 接種到含50 μg/mL 卡那霉素和100 μg/mL 氨芐霉素的LB 液體培養(yǎng)基中， 于37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h 后，轉(zhuǎn)接到1 L 相同培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG，于25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h 后，收集菌體。 取收集后的菌體0.5 g 溶于10 mL 的100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液中，超聲破碎，開2 s 停3 s，破碎后的菌體在4 ℃條件下，12 000 g 離心10 min，上清液與沉淀分開。 樣品經(jīng)處理后，分別用于9 g/dL 的SDS-PAGE 電泳檢測(cè)分析，確定兩個(gè)目的蛋白質(zhì)脫氧核糖醛縮酶和醇脫氫酶的可溶性表達(dá)情況。

1.4 全細(xì)胞催化反應(yīng)及體系優(yōu)化

1.4.1 全細(xì)胞催化反應(yīng)及產(chǎn)物前處理 將收集的菌體用生理鹽水洗滌，4 ℃下除去上清液， 重復(fù)3次，離心即獲得濕菌體，稱取0.8 g 的濕菌體用于生物催化反應(yīng)。

反應(yīng)體系：在10 mL 的100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 （pH 8.0） 中， 加入200 mmol/L 氯乙醛和400 mmol/L 乙醛， 然后加入200 mmol/L 的NADP+和0.8 g的E. coli BL21/pET28-SsDERA/pET21-LeADH 濕菌體，于30 ℃、200 r/min 條件下反應(yīng)16 h。

前處理過程： 反應(yīng)液于12 000 g 離心10 min，除去菌體后， 取上清液用10 mL 乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液，加入無(wú)水Na2SO4除水靜置。

1.4.2 高分辨LC-MS 檢測(cè) 樣品前處理： 樣品溶于純甲醇溶劑中， 用0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜過濾，備用。

液相條件： 色譜柱為Kinetex 2.6 μ C18 100A（100 mm×2.1 mm），流量為0.3 mL/min，柱溫40 ℃。流動(dòng)相A 為乙腈，B 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水， 梯度為：0～1 min，98% B；1～6 min，98% B 到5% B；6～8 min，5% B；進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為350 ℃，去簇電壓DP為80 V，碰撞能量為10 eV，正離子模式，掃描范圍100～1 500。

1.4.3 反應(yīng)體系pH 的優(yōu)化 反應(yīng)體系的緩沖溶液替換為不同pH 緩沖溶液，梯度設(shè)定為pH 值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液和pH值為8.5、9.0 的100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液。 反應(yīng)體系按比例減小為2 mL， 經(jīng)反應(yīng)完成后按照1.4.1的方法分別進(jìn)行前處理， 通過氣相質(zhì)譜GC-MS 進(jìn)行產(chǎn)物含量對(duì)比分析，確定最適反應(yīng)pH[20]。

氣質(zhì)檢測(cè)條件： 柱子選用HP-5 非極性柱（30 m×250 mm×0.25 mm）。 1 μL 的進(jìn)樣量，分流比為19∶1，氮?dú)庾鳛檩d氣，壓力為100 KPa。 升溫程序設(shè)定為50 ℃保持5 min，以10 ℃/min 升溫至250 ℃（5 min），檢測(cè)器溫度為250 ℃。

1.5 目的產(chǎn)物分離及鑒定

在最適反應(yīng)pH 條件下， 重組菌株在2×10 mL催化反應(yīng)體系下按照方法1.4.1 處理， 萃取液樣品進(jìn)行旋蒸，得到的產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜柱進(jìn)行樣品純化，制備獲得目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL。 其中，硅膠柱純化所用洗脫液為乙酸乙酯（EA）與石油醚（PE），VEA∶VPE=1∶3；硅膠板所用展開劑為VPE∶VEA∶V乙酸=20∶10∶1，顯色劑選用5%的硫酸乙醇溶液。 收集洗脫液，通過薄層色譜（TLC）硅膠板確定洗脫產(chǎn)物位置，并將得到的洗脫產(chǎn)物溶于氘代氯仿中，控制質(zhì)量濃度為40 mg/mL，進(jìn)行核磁共振（1H-NMR）鑒定，并計(jì)算反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL 的生成產(chǎn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株構(gòu)建及蛋白表達(dá)分析

按照方法1.3.1， 將合成的兩個(gè)重組質(zhì)粒pET28-SsDERA 和pET21-LeADH 共轉(zhuǎn)化入同一感受態(tài)細(xì)胞中， 獲得目標(biāo)重組菌株E. coli BL21/pET28-SsDERA/pET21-LeADH。 按照1.3.2 的方法進(jìn)行重組菌株培養(yǎng)， 收集的菌體溶解于緩沖液后，進(jìn)行細(xì)胞破碎。 離心收集破碎后的菌液，上清液與沉淀分開，分別經(jīng)過蛋白質(zhì)變性處理后，用于SDSPAGE 的分析，結(jié)果見圖2。 其中來(lái)自Streptococcus suis 的脫氧核糖醛縮酶理論蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為22 970，來(lái)自Lodderomyces elongisporus 的醇脫氫酶理論蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為37 340。 從圖2 蛋白質(zhì)條帶可以看到，電泳圖中兩條明顯的目的條帶與它們的理論相對(duì)分子質(zhì)量加上6×His 標(biāo)簽的蛋白質(zhì)大小一致， 說(shuō)明兩個(gè)蛋白質(zhì)SsDERA 和LeADH 均正確表達(dá)，且表達(dá)量較高。 由此說(shuō)明，兩個(gè)酶均在共轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，此重組菌株可進(jìn)一步應(yīng)用于生物催化反應(yīng)。

2.2 全細(xì)胞催化反應(yīng)及產(chǎn)物獲取

為了確定構(gòu)建的重組菌株是否具有 “一步”催化反應(yīng)過程的能力， 實(shí)現(xiàn)由底物乙醛與氯乙醛反應(yīng)，直接合成得到目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL。 我們利用此重組菌株進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，并對(duì)獲取的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè)。 其中， 催化反應(yīng)體系按照方法1.4.1進(jìn)行操作。 反應(yīng)完成后的樣品經(jīng)過方法1.4.1 前處理過程，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯溶劑，最終可以得到黃色油脂狀的產(chǎn)物，并對(duì)產(chǎn)物樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。

圖2 重組蛋白質(zhì)SsDERA 和LeADH 表達(dá)SDS-PAGE 分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant SsDERAand LeADH expression

2.3 LC-MS 檢測(cè)結(jié)果

由于沒有市售的標(biāo)準(zhǔn)品用于比對(duì)，需建立確定目標(biāo)產(chǎn)物的檢測(cè)方法。 在獲得黃色油脂狀粗產(chǎn)物后，為確認(rèn)其是否含有CTeHL，稱取部分樣品按照方法1.4.2 前處理后，經(jīng)由LC-MS 分析檢測(cè)。 其中液相質(zhì)譜的檢測(cè)條件設(shè)定按照方法1.4.2 所示，經(jīng)分析處理后， 物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果見圖3。 目標(biāo)產(chǎn)物（3R，5S）-6-氯-2，4，6-三脫氧己內(nèi)酯（C6H9ClO3），單一同位素的理論質(zhì)荷比（m/z）為164.024 0，加H+峰的質(zhì)荷比為165.031 3， 實(shí)測(cè)結(jié)果為165.031 4， 結(jié)果一致。 由此可以確認(rèn)粗產(chǎn)物中含有目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL，其物質(zhì)結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步檢測(cè)。

2.4 GC-MS 分析催化反應(yīng)體系對(duì)pH 優(yōu)化

在生物催化反應(yīng)中， 反應(yīng)體系的pH 影響酶的催化反應(yīng)效率。 有研究報(bào)道稱目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL 在pH 值大于8.0 的溶液條件下，其穩(wěn)定性不強(qiáng)[19]。 為了進(jìn)一步測(cè)定在全細(xì)胞催化反應(yīng)體系下重組菌株的最適反應(yīng)pH， 選擇在pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 梯度條件下進(jìn)行測(cè)定。

在不同的pH 緩沖液中， 反應(yīng)樣品按照方法1.4.3 進(jìn)行催化反應(yīng)。由于目標(biāo)產(chǎn)物沒有標(biāo)準(zhǔn)品用來(lái)進(jìn)行定量分析，通過利用萃取產(chǎn)物在氣相質(zhì)譜測(cè)定下產(chǎn)物的碎片離子峰結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道文章[21]中CTeHL 的分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確定結(jié)果一致，并最終確定目標(biāo)產(chǎn)物出峰時(shí)間和位置。 氣相質(zhì)譜的檢測(cè)條件按照方法1.4.3 設(shè)置，GC-MS 圖譜結(jié)果見圖4。其中18.62 min 的出峰位置為目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL 的出峰位置。 在控制樣品處理過程和檢測(cè)進(jìn)樣量相同的條件下， 通過對(duì)不同pH 反應(yīng)液樣品中目標(biāo)產(chǎn)物出峰位置的峰面積比來(lái)進(jìn)行比較，確定全細(xì)胞催化反應(yīng)體系下的最適pH。 通過結(jié)果分析計(jì)算，在不同pH 緩沖液條件下， 得到的重組菌株催化效能相對(duì)百分比見圖5。

圖3 質(zhì)譜分析結(jié)果Fig. 3 Mass spectrometryanalysis

圖4 粗產(chǎn)物氣質(zhì)聯(lián)用圖譜Fig. 4 GC-MS of crude product

在pH 7.5 的緩沖體系下，重組菌株反應(yīng)催化生成目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL 的產(chǎn)率是最高的。

圖5 不同pH 緩沖液下重組菌株催化效能相對(duì)百分比Fig. 5 Relative percentage of catalytic efficiency of the recombinant strain under different pH buffers

2.5 CTeHL 的獲取及鑒定

在利用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀確定了合成得到的黃色油脂狀粗產(chǎn)物物質(zhì)中含有目標(biāo)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量后，為了進(jìn)一步確認(rèn)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)是否正確，我們利用硅膠柱層析色譜分離的方法對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，進(jìn)而對(duì)制備純化得到的物質(zhì)用氫譜（1H-NMR）進(jìn)行產(chǎn)物鑒定。 確認(rèn)重組菌株全細(xì)胞催化反應(yīng)條件下最適緩沖體系pH 7.5 后， 在最適反應(yīng)緩沖體系條件下，按照方法1.5 進(jìn)行合成反應(yīng)，反應(yīng)液處理后得到的粗產(chǎn)物同樣按照方法1.5 用于硅膠柱純化制備目標(biāo)產(chǎn)物，洗脫樣品薄層色譜（TLC）點(diǎn)板的結(jié)果見圖6。 收集得到的洗脫樣品，旋蒸除去溶劑后，得到目標(biāo)樣品。取部分樣品溶于氘代氯仿中，進(jìn)行1H-NMR鑒定，結(jié)果確定分離得到的目標(biāo)樣品就是（3R，5S）-6-氯-2，4，6-三脫氧己內(nèi)酯。 最終，分離得到的樣品質(zhì)量為162.95 mg， 理論上底物全部轉(zhuǎn)化完全應(yīng)得到662.40 mg， 因此重組菌株在pH 7.5 緩沖液反應(yīng)體系下催化得到目標(biāo)產(chǎn)物CTeHL 的產(chǎn)率為24.6%。CTeHL 氫譜結(jié)果為：1H-NMR（400 MHz）CDCl3δ 為1.98～2.04（m，1H），2.62（d，2H），3.01（d，1H），3.59～3.74（dd，2H），4.39（d，1H），4.90～4.96（m，1H）。

圖6 TLC 產(chǎn)物分析結(jié)果Fig. 6 TLC product analysis

3 結(jié) 語(yǔ)

采用生物偶聯(lián)法，把兩個(gè)分別攜帶有不同基因的重組質(zhì)粒pET28-SsDERA 和pET-21-LeADH 導(dǎo)入同一感受態(tài)E.coli BL21 細(xì)胞中， 構(gòu)建重組菌株E. coli BL21/pET28 -SsDERA/pET21 -LeADH。SsDERA 催化的反應(yīng)過程存在反應(yīng)平衡，LeADH 的參與反應(yīng)有助于推動(dòng)反應(yīng)平衡向目標(biāo)終產(chǎn)物合成的方向移動(dòng)，提高底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物合成率。 以兩種酶共表達(dá)的重組菌株為生物催化劑，串聯(lián)催化整個(gè)反應(yīng)過程，實(shí)現(xiàn)了重組菌株“一步”催化底物乙醛與氯乙醛，直接生成得到他汀類藥物側(cè)鏈中間體（3R，5S）-6-氯-2，4，6-三脫氧己內(nèi)酯的生物合成方法并鑒定了目標(biāo)產(chǎn)物。 對(duì)利用生物偶聯(lián)法完全合成他汀類藥物側(cè)鏈中間體進(jìn)行了探索性的研究，為進(jìn)一步相關(guān)研究提供了借鑒。