劉維 陸展華 盧東柏 王曉飛 王石光 薛皦 何秀英

水稻小穗簇生基因的定位及候選基因分析

劉維 陸展華 盧東柏 王曉飛 王石光 薛皦 何秀英*

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所/廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640;*通信聯(lián)系人, E-mail: xyhe@163.com）

【】通過(guò)對(duì)水稻小穗簇生基因的定位與候選基因分析，為進(jìn)一步克隆幼穗發(fā)育過(guò)程中縮短枝梗長(zhǎng)度造成小穗簇生的功能基因奠定基礎(chǔ)。以航天誘變育種技術(shù)處理常規(guī)優(yōu)質(zhì)稻品種粵農(nóng)絲苗獲得一個(gè)穩(wěn)定遺傳的小穗簇生突變體為試驗(yàn)材料，與粵金銀占構(gòu)建F1、F2作圖群體，對(duì)簇生基因進(jìn)行定位，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)蜻x基因進(jìn)行預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)。遺傳分析結(jié)果表明，突變體的簇生性狀由非完全顯性單基因控制，混合分組分析法將該基因定位于第6染色體上約416 kb的區(qū)間。進(jìn)一步通過(guò)表達(dá)譜分析、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)、基因序列差異性分析和qRT-PCR驗(yàn)證等篩選出為最佳候選基因，其5′-UTR區(qū)域發(fā)生9個(gè)堿基的插入突變，暗示該基因可能通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變調(diào)控轉(zhuǎn)錄或翻譯水平，參與水稻幼穗發(fā)育過(guò)程中枝梗的分化?！尽勘狙芯拷Y(jié)果為解析水稻二次枝梗和小穗?？s短機(jī)制奠定一定理論基礎(chǔ)。

航天誘變；小穗簇生；基因定位；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；候選基因

水稻（L.）不僅是世界上最重要的糧食作物，還是禾本科作物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域重要的模式植物[1-2]。穗是水稻產(chǎn)量形成的關(guān)鍵部位，穗型是株型的重要組成部分[3-4]。水稻穗的形成過(guò)程不僅是植株形態(tài)建成中的重要事件，也是決定水稻能否順利完成正常生殖發(fā)育的重要階段之一，并且穗部結(jié)構(gòu)與水稻產(chǎn)量息息相關(guān)[5]。水稻穗部形態(tài)主要由枝梗分化和小穗的著生位置決定[6]，它的形成涉及營(yíng)養(yǎng)分生組織、花序分生組織及花分生組織之間復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過(guò)程[7]。目前，對(duì)雙子葉模式植物花序發(fā)育的生物學(xué)過(guò)程研究很詳細(xì)，但是對(duì)單子葉植物，特別是水稻穗發(fā)育過(guò)程的研究進(jìn)展十分緩慢。

現(xiàn)今主要通過(guò)同源基因的克隆和不同類(lèi)型的突變體來(lái)研究水稻幼穗發(fā)育調(diào)控機(jī)制[8]，Kobayashi等根據(jù)控制發(fā)育的階段將它們分為3類(lèi)[9]。第1階段的基因突變可能阻斷莖端分生組織向花序分生組織轉(zhuǎn)化，如基因能導(dǎo)致花序分生組織的不確定性，超量表達(dá)基因會(huì)出現(xiàn)抽穗期提前，干擾基因表達(dá)植株開(kāi)花期延遲，引起短穗和穗部枝梗減少，嚴(yán)重時(shí)表現(xiàn)為不抽穗[10]；基因編碼F-box蛋白，超量表達(dá)植株表現(xiàn)出花序分生組織轉(zhuǎn)變時(shí)間延長(zhǎng)，干擾表達(dá)植株花序分生組織轉(zhuǎn)變時(shí)間提前[11-13]；被稱(chēng)為盒基因，編碼類(lèi)磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白，在花分生組織的決定中發(fā)揮重要作用，過(guò)表達(dá)的水稻幼苗表現(xiàn)出節(jié)間伸長(zhǎng)提前、地上部的冠狀根發(fā)育、株高變矮以及早花等早熟表型，側(cè)芽發(fā)育也加速，芽會(huì)頻繁生長(zhǎng)成有效分蘗，突變體在形成花的位置形成幼苗，同時(shí)影響穗軸和枝梗伸長(zhǎng)[14-15]。第2階段基因主要維持花序分生組織的特性并控制其向花分生組織轉(zhuǎn)化，突變將影響穗的發(fā)育。（IDEAL PLANT ARCHITECTURE1）基因編碼類(lèi)Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期控制水稻分蘗，在生殖生長(zhǎng)期高表達(dá)促進(jìn)穗分枝，在稻瘟病菌侵染時(shí)受誘導(dǎo)磷酸化提高免疫反應(yīng)，既能增產(chǎn)又能提高稻瘟病抗性[16-18]。表達(dá)量降低，影響OsER1-OsMKKK10-OsMKK4- OsMPK6信號(hào)通路，引起花序分裂組織中細(xì)胞分裂素積累，進(jìn)而增加穎花數(shù)，提高水稻產(chǎn)量[19-20]。第3階段基因主要在花器官發(fā)育過(guò)程中起作用。水稻中的A類(lèi)基因、在各分生組織和各輪花器官原基中均表達(dá)，調(diào)控水稻開(kāi)花啟動(dòng)并決定花器官原基的特性，過(guò)表達(dá)可使開(kāi)花提前，并加速莖分生組織分蘗[21-24]。水稻中的B類(lèi)基因、、調(diào)控漿片和雄蕊的發(fā)育[25-27]，水稻中的C類(lèi)基因、調(diào)控心皮和雄蕊發(fā)育[28-29]。水稻中的D類(lèi)基因僅在心皮壁內(nèi)部細(xì)胞和胚珠原基中表達(dá)，功能缺失突變體雄性不育，胚珠轉(zhuǎn)變成心皮狀結(jié)構(gòu)，心皮內(nèi)部出現(xiàn)心皮[30-31]，在胚珠和心皮壁中均表達(dá)，突變體沒(méi)有明顯表型，不能正常控制胚珠特征的決定[32]。水稻中E類(lèi)基因、、（與同源）、（與同源）、在各輪花器官中重疊表達(dá)，影響花器官的發(fā)育[33]。雖然上述大部分基因已被克隆，但是控制前兩個(gè)階段的基因數(shù)量少且很多與性狀間不存在連接點(diǎn)即缺少相應(yīng)的突變體，因此不能完全確認(rèn)其在水稻發(fā)育中的功能，限制了人們對(duì)水稻幼穗分化發(fā)育分子機(jī)制的理解。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)源激素和許多microRNA（miRNA）也在穗型發(fā)育的枝梗分化過(guò)程中影響廣泛而調(diào)控機(jī)制簡(jiǎn)約。有研究者找到一條miR396控制水稻枝梗有無(wú)的通路[34]，但是關(guān)于水稻枝?？s短的機(jī)制仍然知之甚少。

航天誘變育種技術(shù)又稱(chēng)空間誘變育種或航天誘變育種，是指用航天器(返回式衛(wèi)星、高空氣球、航天飛機(jī)、宇宙飛船等)將農(nóng)作物種子帶到一定的空間環(huán)境，誘導(dǎo)作物種子發(fā)生突變和變異，再在地面選育新材料、新種質(zhì)，培育新品種的作物育種新方法[35-36]。粵農(nóng)絲苗由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所育成，是當(dāng)前廣東省豐、抗、優(yōu)綜合最好的水稻品種之一，分別被列為廣東省和廣州市優(yōu)質(zhì)稻主導(dǎo)品種[37-38]，通過(guò)了海南、廣西、湖北、湖南、江西、安徽、河南等多個(gè)省份品種審定或引種許可，以其為父本配組的雜交稻組合超過(guò)30個(gè)，且多個(gè)組合通過(guò)國(guó)家品種審定（數(shù)據(jù)來(lái)自國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心網(wǎng)站）。2011年通過(guò)神州八號(hào)飛船搭載粵農(nóng)絲苗干種子100粒進(jìn)行航天誘變育種試驗(yàn)，從誘變2代中獲得一個(gè)花序結(jié)構(gòu)異常、二次枝梗和小穗梗嚴(yán)重縮短，頂端小穗3粒簇生在一起的小穗簇生突變體材料(clustered spikelets 6)。前期對(duì)其開(kāi)展了農(nóng)藝性狀調(diào)查、花粉育性觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)該突變體農(nóng)藝性狀與粵農(nóng)絲苗極為相似，熟色好，產(chǎn)量高，但花序結(jié)構(gòu)異常，一次枝梗數(shù)增加，二次枝梗和小穗梗縮短。細(xì)胞學(xué)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)差異主要由幼穗分化的第Ⅲ期到第Ⅳ期發(fā)育異常所致，遺傳分析表明該性狀由1對(duì)半顯性基因控制[39-40]。在此基礎(chǔ)上，為了深入解釋小穗發(fā)育過(guò)程中枝?？s短的分子機(jī)理，本研究利用混合群體分離分析(bulked segregate analysis, BSA)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法對(duì)小穗簇生基因進(jìn)行定位及候選基因分析，篩選造成突變體小穗簇生性狀的候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用航天誘變育種技術(shù)處理粵農(nóng)絲苗，田間篩選得到小穗簇生突變體，自交，簇生性狀能多代穩(wěn)定遺傳，命名為，中文名為粵花占1號(hào)，已獲得農(nóng)業(yè)部植物新品種權(quán)?；浗疸y占是由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所選用的粵金油占與粵銀絲苗雜交而成的感溫型常規(guī)稻品種，抗倒力強(qiáng)，后期熟色好，高抗稻瘟病。將突變體與粵金銀占雜交構(gòu)建F2定位群體約1000株。所有材料種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所大豐試驗(yàn)基地，插植規(guī)格為20 cm×16.7 cm，常規(guī)肥水管理。

1.2 分子標(biāo)記定位基因

以粵金銀占為母本，為父本雜交得到F1代，再自交得到F2代定位群體971株。用CTAB法提取兩個(gè)親本及分離群體葉片DNA保存于?4℃冰箱中備用。選取均勻分布于水稻12條染色體上的600對(duì)SSR標(biāo)記，在兩個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，找到具有多態(tài)性的標(biāo)記。采用BSA法從粵金銀占/F2分離群體中隨機(jī)選取小穗簇生和正常穗型各15株單株DNA，等量混合構(gòu)建突變型和野生型DNA混池。利用多態(tài)性分子標(biāo)記對(duì)兩個(gè)DNA混池進(jìn)行基因型分析并篩選出連鎖標(biāo)記。最后用篩選到的連鎖標(biāo)記對(duì)129株隱性單株DNA進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，完成基因定位。

PCR擴(kuò)增儀為C1000TM熱循環(huán)儀，反應(yīng)體系為15.0 μL：5 U/μLDNA聚合酶0.5 μL，10×緩沖液（含Mg2+）1.5 μL，DNA模板1.0 μL，dNTP 0.5 μL，正、反向引物各0.3 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94℃下預(yù)變性3 min；94℃下30 s，55℃下30 s，72℃下45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃下延伸10 min。6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（北京市六一儀器廠垂直電泳系統(tǒng)），銀染顯色，Gel DocTM XR+凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。統(tǒng)計(jì)交換個(gè)體數(shù)，按照重組頻率=（雙交換個(gè)體×2+單交換個(gè)體）/（總個(gè)體數(shù)×2）×100的公式計(jì)算重組頻率，用Kosanbi函數(shù)將重組頻率轉(zhuǎn)化成遺傳距離。根據(jù)Gramene網(wǎng)站上提供的水稻基因組序列信息構(gòu)建物理圖譜。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

由于小穗發(fā)育第Ⅰ期（第一苞形成）到第Ⅲ期（二次枝梗與小花分化）二次枝梗和小穗梗均未伸長(zhǎng)，第Ⅲ期（二次枝梗與小花分化）到第Ⅳ期（雌雄蕊形成）二次枝梗和小穗梗基本無(wú)伸長(zhǎng)而野生型粵農(nóng)絲苗按比例伸長(zhǎng)，差異極顯著。故分別剝離野生型和突變體小穗發(fā)育第Ⅲ期和第Ⅳ期的幼穗各3份保存于液氮中，快速取出加入10倍體積的TRIZOL（Invitrogene）提取總RNA，溶于去RNA酶ddH2O，置于1.5 mL無(wú)酶離心管中，使用Parafilm封住管口。將提取的總RNA用干冰送至北京百邁客生物科技有限公司，公司使用Nanodrop 2000與Agilent 2100檢測(cè)總RNA質(zhì)量、純度、完整性等，檢測(cè)合格的樣品使用AMARTer PCR cDNA合成試劑盒合成全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建質(zhì)量合格的文庫(kù)?；谶吅铣蛇厹y(cè)序（Sequencing By Synthesis，SBS）技術(shù)，采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，過(guò)濾得到Clean Data，與日本晴參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲得差異表達(dá)基因信息，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因聚類(lèi)、基因功能注釋、基因富集及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。

1.4 候選基因預(yù)測(cè)

參考日本晴的基因組序列，利用水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)分子標(biāo)記與目標(biāo)基因之間的物理距離和遺傳距離，在定位區(qū)段上獲取目的基因信息。從公共數(shù)據(jù)庫(kù)CREP中查找候選基因在秈稻品種明恢63不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步篩選出目標(biāo)基因。

1.5 候選基因表達(dá)量分析

取野生型和突變體幼穗發(fā)育Ⅲ期到Ⅳ期轉(zhuǎn)變時(shí)期的幼穗樣品，使用RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN公司，德國(guó))提取RNA，用甲醛凝膠電泳檢測(cè)其完整性，使用ReverTra Ace qPCR PCR Kit(TOYOBO公司，日本)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA后備用。利用試劑盒SYBR qPCR Mix Kit(TOYOBO公司，日本)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500），以Ⅰ(GeneBank登錄號(hào)：NM_001058705)基因作為內(nèi)參，分析預(yù)測(cè)候選基因在野生型和突變體中的相對(duì)表達(dá)量。

反應(yīng)體系為20.0 μL：10 μL 2×SYBR qPCR混合液，2 μL cDNA模板，正反引物各0.8 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃下30 s；95℃下5 s，55℃下30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃下1 min。3次生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)，以2–??Ct計(jì)算候選基因的表達(dá)量。

1.6 候選基因序列分析

針對(duì)候選基因啟動(dòng)子和編碼區(qū)段，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0分段重合設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出候選基因的基因組序列，擴(kuò)增產(chǎn)物委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用DNAstar 5.0軟件拼接組合，同時(shí)利用DNAMAN 6.0.3.99軟件對(duì)比基因序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 簇生突變體cl6的表型鑒定及基因定位

農(nóng)藝性狀與粵農(nóng)絲苗極為相似，在生育期、株高、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、一次枝梗長(zhǎng)、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)及產(chǎn)量這些農(nóng)藝性狀上沒(méi)有明顯差異；而一次枝梗數(shù)、結(jié)實(shí)率及籽粒長(zhǎng)寬比的差異均達(dá)到顯著水平，特別是二次枝梗長(zhǎng)和小穗梗長(zhǎng)比粵農(nóng)絲苗嚴(yán)重縮短（圖1）。

以粵金銀占為母本，為父本雜交得到F1代，自交得到F2代定位群體971株。選取均勻分布于水稻12條染色體上的600對(duì)SSR標(biāo)記，在兩個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，找到具有多態(tài)性的標(biāo)記136對(duì)。根據(jù)多態(tài)性結(jié)果，經(jīng)3輪連鎖分析，將基因定位在第6染色體分子標(biāo)記RM20315和RM20341之間約3.88 cM的區(qū)域內(nèi)，并將其命名為。利用定位所用的分子標(biāo)記并通過(guò)BLADTN分析，構(gòu)建的物理圖譜（圖2），側(cè)翼標(biāo)記RM20315和RM20341分別錨定物理距離約為416 kb。

2.2 Oscl6候選區(qū)間基因結(jié)構(gòu)分析與基因表達(dá)分析

以日本晴的基因組序列作為參考，查詢(xún)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)后發(fā)現(xiàn)，在定位區(qū)間內(nèi)共有68個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中功能基因53個(gè)，轉(zhuǎn)座子蛋白3個(gè)，反轉(zhuǎn)座子蛋白12個(gè)，未發(fā)現(xiàn)已克隆的與二次枝梗和小穗梗長(zhǎng)度發(fā)育相關(guān)的基因。

為了在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)尋找最有可能的候選基因，我們從公共數(shù)據(jù)庫(kù)CREP中查找了定位區(qū)間內(nèi)預(yù)測(cè)基因在秈稻品種明恢63不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出在水稻幼穗發(fā)育時(shí)期較高表達(dá)的基因11個(gè)（表1），其中功能基因10個(gè)，轉(zhuǎn)座子蛋白1個(gè)。比較發(fā)現(xiàn)（）、、、、這5個(gè)基因僅在幼穗中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，即在幼穗組織中比其他組織中的表達(dá)量都高（圖3），這與Wang等[41]結(jié)果一致。我們認(rèn)為這些候選基因參與枝梗發(fā)育的可能性較大。

2.3 OsCL6候選基因的鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推論，我們首先采用qRT-PCR檢測(cè)了基因在野生型和突變體幼穗分化Ⅲ期到Ⅳ期的表達(dá)量。結(jié)果表明，中的基因表達(dá)量極顯著下調(diào)，在野生型對(duì)照基因相對(duì)表達(dá)量為1的前提下，突變體基因的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為原來(lái)的1/20（圖4-A）。基因全長(zhǎng)1146 bp，編碼蛋白含有382個(gè)氨基酸，N端由42個(gè)氨基酸組成一個(gè)F-box基序，C端有兩個(gè)與蛋白-蛋白互作相關(guān)的Kelch二級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)基因序列及啟動(dòng)子區(qū)域，分段重合設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增野生型和突變體的基因編碼序列和啟動(dòng)子序列，經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，與參考基因組日本晴和野生型粵農(nóng)絲苗相比，突變體植株中基因的編碼序列無(wú)差異，而其啟動(dòng)子在距離起始密碼子185 bp的5′-UTR區(qū)域發(fā)生了9個(gè)堿基的插入突變（圖4-B）。針對(duì)啟動(dòng)子缺失區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對(duì)F2群體中15個(gè)隱性性狀個(gè)體和15個(gè)顯性性狀個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)插入突變與簇生性狀共分離（圖4-C）。綜合上述結(jié)果，我們推測(cè)基因?yàn)檎{(diào)控水稻枝梗發(fā)育的候選基因。

圖1 粵農(nóng)絲苗(WT)與cl6的表型

Fig. 1. Phenotypes of Yuenongsimiao(WT) and.

圖2 OsCL6基因的定位

Fig. 2. Gene mapping of

表1 幼穗發(fā)育時(shí)期高表達(dá)的11個(gè)基因

1?萌發(fā)后的胚和胚根; 2?浸泡72 h后的種子；3?二蘗苗的根；4?二蘗苗的地上部；5?3葉期的葉和根；6?幼穗分化Ⅲ期的葉片；7?幼穗長(zhǎng)達(dá)4~5 cm時(shí)的葉片；8?抽穗前5 d的劍葉；9?抽穗前14 d的劍葉；10?幼穗分化Ⅲ期的莖鞘；11?幼穗長(zhǎng)達(dá)4~5 cm時(shí)的莖鞘；12?抽穗前5 d的莖鞘；13?抽穗前1 d的穎殼；14?抽穗期的莖；15?處于分化Ⅲ期的幼穗；16?處于分化Ⅳ期的幼穗；17?處于分化V期的幼穗；18?4~5 cm長(zhǎng)幼穗；19?抽穗期的穗；20?開(kāi)花前1 d的雄蕊；21?授粉3 d后的小穗；22?授粉7 d后的胚乳；23?授粉14 d后的胚乳；24?授粉21 d后的胚乳。

Fig. 3. Patterns of dominant expression of candidate genes in young panicles.

2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

為了探索基因的調(diào)控途徑，收集了野生型和突變體幼穗分化Ⅲ~Ⅳ期轉(zhuǎn)變時(shí)期的幼穗樣品各3份，經(jīng)RNA-seq測(cè)序獲得了野生型和突變體植株幼穗的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，共獲得49.29 Gb Clean Data，各樣品的Clean Data均達(dá)到6.99 Gb，Q30堿基百分比在91.94%及以上。分別將各樣品的Clean Reads與日本晴參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)效率從82.41%到83.72%不等?；诒葘?duì)結(jié)果，進(jìn)行可變剪接預(yù)測(cè)分析、基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化分析以及差異表達(dá)基因的發(fā)掘，共獲得差異表達(dá)基因1 439個(gè)，其中1 123個(gè)得到功能注釋?；诒葘?duì)結(jié)果，進(jìn)行基因表達(dá)量分析，共獲得了461個(gè)在突變體中表達(dá)上調(diào)的基因和540個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因（Fold Change>2，F(xiàn)DR<0.01）(圖5-A)。其中，定位區(qū)間的候選基因（）在幼穗發(fā)育期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果也表明其表達(dá)水平存在顯著差異。此外，通過(guò)KEGG通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)突變體與野生型植株相比，許多基因富集在了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物病原菌互作、碳代謝等通路（圖5-B）。通過(guò)對(duì)這些差異表達(dá)基因的功能的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)赤霉素（GA）信號(hào)通路的許多基因發(fā)生富集，預(yù)示著GA信號(hào)通路可能在調(diào)控水稻枝梗發(fā)育中發(fā)揮了重要的作用（圖5-C）。編碼包含F(xiàn)-BOX結(jié)構(gòu)域和Kelch重復(fù)的蛋白，目前從各種植物中已鑒定出大量的F-box蛋白質(zhì)，它們通過(guò)構(gòu)成E3泛素連接酶復(fù)合體SCF[Skp1-Cdc53 (cullin)-F-box]，參與植物激素(乙烯、生長(zhǎng)素、赤霉素和茉莉酸)的信號(hào)傳導(dǎo)[47-50]。該基因在擬南芥中的同源基因通過(guò)細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑調(diào)控?cái)M南芥的生長(zhǎng)發(fā)育[51]，然而在水稻中尚未見(jiàn)定位、克隆或功能分析的報(bào)道。

3 討論

稻穗為圓錐花序，由穗軸、一次枝梗、二次枝梗、小穗梗和小穗(穎花)組成，穗軸上一般有8~15個(gè)穗節(jié)，一次枝梗著生在各穗節(jié)上，二次枝梗著生在一次枝梗上，各枝梗上著生著小穗梗，其末端著生一個(gè)小穗[52]。水稻穗部形態(tài)主要由枝梗分化和小穗著生位置決定[6]，枝梗分化作為穗發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，包括一次枝梗、二次枝梗及小穗梗等的分化，直接決定水稻能否進(jìn)入和完成生殖發(fā)育過(guò)程，進(jìn)而影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。簇生稻是穗型突變體的一類(lèi)，在主穗軸和枝梗頂端長(zhǎng)著2~3粒穎花，其發(fā)現(xiàn)與研究不但是鑒定穗型發(fā)育功能基因的重要途徑之一，也是水稻新品種選育、生物技術(shù)研究以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)[53-54]。研究人員在長(zhǎng)期的田間工作中，利用航天技術(shù)誘變廣東省水稻主導(dǎo)品種粵農(nóng)絲苗，發(fā)現(xiàn)一個(gè)全新的小穗簇生突變體材料，不同于以往的研究，簇生性狀是由于二次枝梗和小穗?？s短所致，是一個(gè)優(yōu)良的新種質(zhì)材料，定名粵花占1號(hào)[39]，并于2019年獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)部授予的農(nóng)作物新品種權(quán)(品種權(quán)號(hào)CNA20151728.8)。該材料首先豐富了水稻突變體的多樣性，適用于穗型發(fā)育過(guò)程中枝梗伸長(zhǎng)縮短分子機(jī)理的研究；其次，通過(guò)對(duì)非簇生水稻簇生性狀的轉(zhuǎn)育，能提高穗著粒密度及每穗粒數(shù)、有效縮短穗長(zhǎng)度及改良稻米品質(zhì)；此外，該突變體在抽穗灌漿期具有觀賞性，可滿(mǎn)足觀光農(nóng)業(yè)發(fā)展的迫切需要。

A?采用qRT-PCR驗(yàn)證OsFKB16基因的表達(dá)差異; B?OsFKB16的啟動(dòng)子測(cè)序結(jié)果; C?OsFKB16的啟動(dòng)子共分離驗(yàn)證。WT?粵農(nóng)絲苗。

Fig. 4. Candidate genevalidation.

A?差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析，log2(FPKM+1); B?差異表達(dá)基因KEGG通路富集散點(diǎn)圖；C?GA合成代謝和信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)差異。

Fig. 5. Partial analysis results of transcriptome sequencing of the wild type and its mutant.

遺傳分析表明控制簇生性狀的基因?yàn)榘腼@性單基因，BSA性狀定位法將該基因定位于第6染色體約416 kb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間共有68個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）。公共數(shù)據(jù)庫(kù)CREP中發(fā)現(xiàn)明恢63在該區(qū)間內(nèi)有11個(gè)基因在幼穗發(fā)育時(shí)期高表達(dá)，包括10個(gè)功能基因和1個(gè)轉(zhuǎn)座子蛋白，其中有5個(gè)基因只在幼穗中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。野生型與突變體幼穗發(fā)育3~4期的幼穗轉(zhuǎn)錄組分析表明，定位區(qū)間內(nèi)的68個(gè)基因有5個(gè)基因呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)（2倍）。而基因在幼穗中優(yōu)勢(shì)高表達(dá)，在突變體中的表達(dá)量顯著下調(diào)，并且該基因5′-UTR區(qū)具有9個(gè)堿基的插入突變，導(dǎo)致植物激素相關(guān)基因差異表達(dá)，因此，我們認(rèn)為該基因是候選基因。

真核生物體內(nèi)，F(xiàn)-box蛋白在泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)中參與調(diào)控胞內(nèi)蛋白降解、受體識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程[55]。F-box蛋白作為泛素連接酶復(fù)合物(Skp1-Cullin1- F-box, SCF)的調(diào)節(jié)亞基，參與降解底物的特異性識(shí)別[56]。LOC_Os06g39370編碼一個(gè)含有382個(gè)氨基酸的F-box結(jié)構(gòu)蛋白，其同源基因在擬南芥中通過(guò)細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑控制擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育[51]，然而在水稻中尚未見(jiàn)定位、克隆或功能分析的報(bào)道。對(duì)該基因序列及啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行測(cè)序拼接對(duì)比，發(fā)現(xiàn)突變體在啟動(dòng)子區(qū)有9個(gè)bp的插入突變，暗示其可能通過(guò)啟動(dòng)子二級(jí)結(jié)構(gòu)等的改變來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，調(diào)控下游基因的表達(dá)，幼穗發(fā)育過(guò)程中枝梗伸長(zhǎng)受阻，稻穗出現(xiàn)簇生表型。

水稻穗型發(fā)育是眾多基因參與調(diào)控的一個(gè)復(fù)雜而有序的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從當(dāng)前的研究來(lái)看，參與水稻穗型發(fā)育的基因可以分為5類(lèi)：腋生分生組織起始相關(guān)基因、分生組織發(fā)育時(shí)間轉(zhuǎn)換相關(guān)基因、調(diào)控花序結(jié)構(gòu)內(nèi)枝梗及穗長(zhǎng)相關(guān)基因、調(diào)控穗中多種分生組織的細(xì)胞特性基因、穗軸和花序分生組織標(biāo)記基因[57]。植物內(nèi)源激素如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、獨(dú)腳金內(nèi)脂等，多是通過(guò)調(diào)節(jié)分枝原基的產(chǎn)生與伸長(zhǎng)參與穗型的遺傳調(diào)控[58-60]，獨(dú)腳金內(nèi)酯作為新型植物激素能夠抑制分枝并參與多種發(fā)育過(guò)程[61-62]，油菜素內(nèi)酯是否參與調(diào)控水稻穗型形成及相關(guān)機(jī)理還有待研究確認(rèn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)許多microRNA（miRNA）也在穗型發(fā)育的枝梗分化過(guò)程中影響廣泛而調(diào)控機(jī)制簡(jiǎn)約而備受關(guān)注。如miR172的通過(guò)靶基因決定枝梗分生組織的分枝程度[63]，miR396通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)水稻二次枝梗數(shù)和每穗粒數(shù)，并最終控制水稻產(chǎn)量[34]。據(jù)筆者統(tǒng)計(jì)，截至目前共有19個(gè)一次枝梗分化相關(guān)基因、15個(gè)二次枝梗分化相關(guān)基因被克隆，而它們絕大部分參與枝梗數(shù)的分化調(diào)控，極少數(shù)與枝梗分化長(zhǎng)度相關(guān)。因此，對(duì)本研究突變體材料二次枝梗和小穗梗長(zhǎng)度嚴(yán)重縮短功能基因的鑒定與挖掘就顯得尤為重要?；蛭挥诘?染色體，無(wú)可變剪接，編碼F-box結(jié)構(gòu)蛋白，F(xiàn)-box蛋白質(zhì)是一類(lèi)真核生物中普遍存在的蛋白質(zhì)家族，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解有著關(guān)鍵的調(diào)控作用。該基因在水稻中的功能尚不清楚，亟需進(jìn)一步的工作加以驗(yàn)證和明確。

4 結(jié)論

本研究材料小穗簇生突變體與其野生型相比較，花序結(jié)構(gòu)異常，一次枝梗數(shù)增加，二次枝梗和小穗梗顯著縮短，一次枝梗頂端小穗3粒簇生在一起。遺傳分析表明簇生性狀由單個(gè)半顯性基因控制，BAS性狀定位法將該基因精細(xì)定位于第6染色體分子標(biāo)記RM20315和RM20341之間約3.88 cM/416 kb的區(qū)段。參考日本晴基因組序列，在定位區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)開(kāi)放性閱讀框68個(gè)，表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)其中11個(gè)基因在水稻幼穗發(fā)育時(shí)期高表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到在突變體中的表達(dá)量顯著降低。該基因編碼包含F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域和Kelch重復(fù)的蛋白，通過(guò)構(gòu)成E3泛素連接酶復(fù)合體SCF參與植物激素的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。在水稻中的具體功能尚不清楚。對(duì)該基因序列差異進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子在距離起始密碼子185 bp的5′-UTR區(qū)域發(fā)生9個(gè)堿基的插入突變，能夠通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)的該表調(diào)控翻譯過(guò)程，參與水稻幼穗發(fā)育枝梗分化途徑。本研究結(jié)果為進(jìn)一步克隆新基因并研究其功能，解析水稻穗發(fā)育過(guò)程中二次枝梗和小穗梗縮短的機(jī)理奠定一定的基礎(chǔ)。

[1] 羅瓊, 朱立煌. 水稻花發(fā)育的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 遺傳, 2002(1): 87-93.

Luo Q, Zhu L H. Progress of molecular floral development research in rice[J]., 2002(1): 87-93. (in Chinese with English abstract)

[2] 肖景華, 吳昌銀, 袁猛, 王妮麗, 范優(yōu)榮, 楊猛, 歐陽(yáng)亦聃, 阮一駿, 張啟發(fā). 中國(guó)水稻功能基因組研究進(jìn)展與展望[J]. 科學(xué)通報(bào), 2015, 60(18): 1711-1723.

Xiao J H, Wu C Y, Yuan M, Wang N N, Fan Y R, Yang M, Ouyang Y R, Ruan Y J, Zhang Q F. Advances and prospects of rice functional genomics in China[J]., 2015, 60(18): 1711-1723. (in Chinese)

[3] 淳雁, 李學(xué)勇. 水稻穗型的遺傳調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào), 2017, 52(1): 19-29.

Chun Y, Li X Y. Advances in genetic regulation of panicle shape in rice[J].2017, 52(1): 19-29. (in Chinese)

[4] 陳峰, 高潔, 周繼華, 朱文銀, 朱其松, 孫公臣, 袁守江, 楊連群. 水稻穗型的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 25(5): 1167-1172.

Chen F, Gao J, Zhou J H, Zhu W Y, Zhu Q S, Sun G C, Yuan S J, Yang L Q. Research progress of panicle shape in rice[J].,2009, 25(5): 1167-1172. (in Chinese with English abstract)

[5] Sakamoto T, Matsuoka M. Identifying and exploiting grain yield genes in rice[J]., 2008, 11(2): 209-214.

[6] Ikeda M, Kawarabayashi T, Harigaya Y, Sasaki A, Yamada S, Matsubara E, Murakami T, Tanaka, Kurata T, Xu W H, Ueda K, Kuribara H, Ikarashi Y, Nakazato Y, Okamoto K, Abe K, Mikio S. Motor impairment and aberrant production of neurochemicals in human alpha-synuclein A30P+A53T transgenic mice with alpha-synuclein pathology[J]., 2009, 1250: 232-241.

[7] Li M, Tang D, Wang K J, Wu X R, Lu L L, Yu H X, Gu M H, Yan C J, Cheng Z K. Mutations in the F-box geneimprove the panicle architecture and enhance the grain yield in rice[J].2011, 9(9): 1002-1013.

[8] Luo Q, Zhou K, Zhao X F, Zeng Q C, Xia H G, Zhai W X, Xu J C, Wu X J, Yang L H. Identification and fine mapping of a mutant gene for palealess spikelet in rice[J]., 2005, 221(2): 222-230.

[9] Kaoru K, Masahiko M, Akio M, Hirohiko H, Junko K.(PAP2), encoding a SEPALLATA subfamily MADS-box protein, positively controls spikelet meristem identity in rice[J]., 2010, 51(1): 47-57.

[10] Rao N, Prasad K, Kumar P R, Usha V. Distinct regulatory role for RFL, the rice LFY homolog, in determining flowering time and plant architecture[J]., 2008, 105(9): 3646-3651.

[11] Ikeda K, Ito M, Nagasawa N, Kyozuka J, Nagato Y. Rice, encoding an F-box protein, regulates meristem fate[J]., 2010, 51(6): 1030-1040.

[12] Ookawa T, Hobo T, Yano M, Murata K, Ando T, Miura H, Asano K, Ochiai Y, Ikeda M, Nishitani R, Ebitani T, Ozaki H, Angeles E R, Hirasawa T, Matsuoka M. New approach for rice improvement using a pleiotropic QTL gene for lodging resistance and yield[J]., 2010, 1: 132.

[13] Terao T, Nagata K, Morino K, Hirose T. A gene controlling the number of primary rachis branches also controls the vascular bundle formation and hence is responsible to increase the harvest index and grain yield in rice[J].2010, 120(5): 875-893.

[14] Li F, Liu W, Tang J,Chen J F, Tong H N, Hu B, Li C L, Fang J, Chen M S, Chu C C. Riceis essential for determining panicle outgrowth and elongation[J]., 2010, 20(7): 838-849.

[15] Lu S J, Wei H, Wang, Y, Wang H M, Yang R F, Zhang X B, Tu J M. Overexpression of a transcription factor OsMADS15 modifies plant architecture and flowering time in rice (L.) [J]., 2012, 30(6):1461-1469.

[16] Jiao Y Q, Wang Y H, Xue D W, Wang J, Yan M X, Liu G F, Dong G J, Zeng D L, Lu Z F, Zhu X D, Qian Q , Li J Y. Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice[J]., 2010, 42(6): 541-544.

[17] Miura K, Ikeda M, Matsubara A, Song X J, Ito M, Asano K, Matsuoka M, Kitano H, Ashikari M. OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice[J]., 2010, 42(6): 545-549.

[18] Wang J, Zhou L, Shi H, Chern M S, Yu H, Yi H, He M, Yin J J, Zhu X B, Li Y, Li W T, Liu J L, Wang J C, Chen X Q, Qing H, Wang Y P, Liu G F, Wang W M, Li P, Wu X J, Zhu L H, Zhou J M, Ronald P C, Li S G, Li J Y, Chen X W. A single transcription factor promotes both yield and immunity in rice[J]., 2018, 361(6406): 1026-1028.

[19] Ashikari M, Sakakibara H, Lin S Y,Yamamoto T, Takashi T, Nishimura A, Angeles E R, Qian Q, Kitano H , Matsuoka M. Cytokinin oxidase regulates rice grain production[J], 2005, 309(5735): 741-745.

[20] Guo T, Lu Z Q, Shan J X, Ye W W, Dong N Q, Lin H X. ERECTA1 acts upstream of the OsMKKK10-OsMKK4- OsMPK6 cascade to control spikelet number by regulating cytokinin metabolism in rice[J]., 2020, 32(9): 2763-2779. DOI: https://doi.org/10.1105/ tpc.20.00351

[21] Kobayashi K, Yasuno N, Sato Y, Yoda M, Yamazaki R, Kimizu M, Yoshida H, Nagamura Y, Kyozuka J. Inflorescence meristem identity in rice is specified by overlapping functions of three AP1/FUL-like MADS box genes and, abox gene[J]., 2012, 24(5): 1848-1859.

[22] Lee S, Kim J, Han J J, Han M J, An G. Functional analyses of the flowering time gene, the putative(SOC1/AGL20) ortholog in rice[J]., 2004, 38(5): 754-764.

[23] Masiero S, Imbriano C, Ravasio F, Rebecca F, Nilla P, Sari G M, Roberto M, Lucia C, Kater M M. Ternary complex formation between MADS-box transcription factors and the histone fold protein NF-YB[J]., 2002, 277(29): 26 429-26 435.

[24] Wang K J, Tang D, Hong L, Xu W Y, Huang J, Li M, Gu M H, Xue Y B, Cheng Z K.andregulate reproductive habit in rice[J]., 2010, 6(1): e1000818.

[25] Xiao H, Wang Y, Liu D, Wang W M, Li X B, Zhao X F, Xu J C, Zhai W X, Zhu L H. Functional analysis of the rice AP3 homologue OsMADS16 by RNA interference[J]., 2003, 52(5): 957-966.

[26] Yadav S R, Prasad K, Vijayraghavan U. Divergent regulatory OsMADS2 functions control size, shape and differentiation of the highly derived rice floret second-whorl organ[J]., 2007, 176(1): 283-294.

[27] Yao S G, Ohmori S, Kimizu M, Hitoshi Y. Unequal genetic redundancy of rice PISTILLATA orthologs, OsMADS2 and OsMADS4, in lodicule and stamen development[J]., 2008, 49(5): 853-857.

[28] Nagasawa N, Miyoshi M, Sano Y, Hikaru S, Hiroyuki H, Hajime S, Yasuo N.genes control floral organ identity in rice[J].2003, 130: 705-718.

[29] Yamaguchi T, Nagasawa N, Kawasaki S, Matsuoka M, Nagato Y, Hirano H Y. The YABBY generegulates carpel specification and midrib development in[J]., 2004, 16(2): 500-509.

[30] Li H F, Liang W Q, Yin C S, Zhu L, Zhang D B. Genetic interaction of,, andin specifying rice floral organ identities and meristem determinacy[J]., 2011, 156(1): 263-274.

[31] Lopez-Dee Z P, Wittich P, Pe M E, Gorla M S, Kater M M, Colombo L., a novel rice MADS-box gene expressed during ovule development[J]., 2015, 25(3): 237-244.

[32] Dreni L, Jacchia S, Fornara F, Fornari M, Ouwerkerk P F, An, Colombo G L, KaterM M. The D-lineage MADS-box genecontrols ovule identity in rice[J]., 2010, 52(4): 690-699.

[33] Zhang Y, Yu H, Liu J, Wang W, Sun J, Gao Q, Zhang Y, Wang J, Xu Z. Loss of function of OsMADS34 leads to large sterile lemma and low grain yield in rice (L.)[J]., 2016, 36(11): 147.

[34] Gao F, Wang K, Liu Y,Chen Y P, Chen P, Shi Z Y, Luo J, Jiang D Q, Fan F F, Zhu Y G, Li S Q. Blocking miR396 increases rice yield by shaping inflorescence architecture[J].2015, 2: 15196.

[35] 陳志強(qiáng), 周丹華, 郭濤, 王慧. 水稻航天生物育種研究進(jìn)展[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 40(5): 195-202.

Chen Z Q, Zhou D H, Guo T, Wang H. Research progress of rice space mutation bio-breeding[J].,2019, 40(5): 195-202. (in Chinese with English abstract)

[36] 張福彥, 張建偉, 程仲杰, 陳曉杰, 齊紅志, 楊保安, 范家霖, 崔龍. 航天誘變技術(shù)在小麥育種上的應(yīng)用[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2019, 33(2): 262-269.

Zhang F Y, Zhang J W, Cheng Z J, Chen X J, Qi H Z, Yang B A, Fan J L, Cui L.Application of space mutation technology in wheat breeding[J]., 2019, 33(2): 262-269. (in Chinese with English abstract)

[37] 何秀英, 廖耀平, 陳釗明,程永盛, 陳粵漢, 劉維. 優(yōu)質(zhì)抗病水稻新品種粵農(nóng)絲苗的選育及應(yīng)用[J]. 中國(guó)稻米, 2014, 20(2): 69-70.

He X Y, Liao Y P, Chen Z M, Cheng Y S, Chen Y H, Liu W.Breeding and application of a new rice variety with high quality and disease resistance Yuenongsimiao[J]., 2014, 20(2): 69-70. (in Chinese with English abstract)

[38] 陸展華, 劉維, 盧東柏, 王曉飛, 王石光, 何秀英. 優(yōu)質(zhì)稻品種‘粵農(nóng)絲苗’稻瘟病廣譜抗性遺傳及基因組成分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2020, 21(4): 827-833.

Lu Z H, Liu W, Lu D B, Wang X F, Wang S G, He X Y. Genetic analysis and gene identification of high-quality rice ‘Yuenong Simiao’ with broad spectrum resistance against rice blast[J]., 2020, 21(4): 827-833. (in Chinese with English abstract)

[39] 劉維, 何秀英, 陸展華, 盧東柏, 廖耀平, 陳釗明, 程永盛, 陳粵漢. 水稻穗型突變體的鑒定、保護(hù)與遺傳分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2017, 18(6): 1210-1215.

Liu W, He X Y, Lu Z H, Lu D B, Liao Y P, Chen Z M, Cheng Y S, Chen Y H. Observation and genetic analysis on rice panicle architecture mutant[J]., 2017, 18(6): 1210-1215. (in Chinese with English abstract)

[40] 劉維, 何秀英, 陳釗明, 程永盛, 盧東柏, 廖耀平. 航天誘變水稻小穗簇生突變體的遺傳分析與基因定位[C]//全國(guó)植物航天誘變育種學(xué)術(shù)研討會(huì)2015年學(xué)術(shù)會(huì)議文集. 廣州: 全國(guó)植物航天誘變育種學(xué)術(shù)研討會(huì), 2015: 11.

Liu W, He X Y, Chen Z M, Cheng Y S, Lu D B, Liao Y P. Genetic analysis and gene mapping of rice spikelet cluster mutant CL6 induced by spaceflight[C]// Proceedings of 2015 National Symposium on Plant Space Mutagenesis Breeding. Guangzhou: National Symposium on Plant Space Mutagenesis Breeding, 2015: 11. (in Chinese)

[41] Wang L, Xie W, Chen Yang Q, Tang W J, Yang J Q, Ye R Q, Liu L, Lin Y Q, Xu C Q, Xiao J H, Zhang Q F. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice[J]., 2010, 61(5): 752-766.

[42] Junichi S, Kumiko I, Takeshi N, Nobuhiro I, Masafumi T, Yasuhiro H, Shou T. Characterization of rice nucleotide sugar transporters capable of transporting UDP-galactose and UDP-glucose[J]., 2010, 148(1): 35-46.

[43] Asuka N, Momoyo I, Noriko K, Sato Y, Matsuoka M.regulates leaf development and maintenance of the shoot apical meristem in rice[J]., 2002, 30(2): 189-201.

[44] Yu D, Ranathunge K, Huang H, Pei Z, Franke R, Schreiber L, He C.encodes a β-ketoacyl CoA synthase involved in biosynthesis of cuticular waxes on rice leaf[J], 2008, 228(4): 675-685.

[45] Tomoaki S, Ayami K, Asako T S, Bun-Ichi S, Suguru T, Y Shimada, Shozo F, Mizutani M. Rice CYP734As function as multisubstrate and multifunctional enzymes in brassinosteroid catabolism[J]., 2011, 67(1): 1-12.

[46] Wen J Q, Chao W, Ya P F, Hu G C, He Z Q, Liu W Z. Novel rice mutants overexpressing the brassinosteroid catabolic gene[J]., 2017, 93(1): 197-208.

[47] 吳丹, 唐冬英, 李新梅, 李麗, 趙小英, 劉選明. F-box蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究. 2015, 19(4): 362-367.

Wu D, Tang D Y, Li X M, Li L, Zhao X Y, Liu X M. Progresses on F-box protein function in plant growth and development[J]., 2015, 19(4): 362-367. (in Chinese with English abstract)

[48] 賈琪, 孫松, 孫天昊, 林文雄. F-box蛋白家族在植物抗逆響應(yīng)中的作用機(jī)制[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 26(8): 1125-1136.

Ja Q, Sun S, Sun T H, Lin W X. Mechanism of F-box protein family in plant resistance response to environmental stress[J]., 2018, 26(8): 1125-1136. (in Chinese with English abstract)

[49] 秘彩莉, 劉旭, 張學(xué)勇. F-box蛋白質(zhì)在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能[J]. 遺傳, 2006(10): 1337-1342.

Mi C L, Liu X, Zhang X Y.The function of F-box protein in plant growth and development[J]., 2006(10): 1337-1342. (in Chinese with English abstract)

[50] 許媛, 李鈴仙, 于秀梅, 劉大群. F-box蛋白在植物抗逆境脅迫中的功能[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, 51(7): 1003-1008.

Xu Y, Li L X, Yu X M, Liu D Q. The functions of F-box protein in plant resistance to stress[J]., 2015, 51(7): 1003-1008. (in Chinese with English abstract)

[51] Kim H J, Chiang Y H, Kieber J J, Schaller G E. SCF(KMD) controls cytokinin signaling by regulating the degradation of type-B response regulators[J]., 2013, 110(24): 10 028-10 033.

[52] 伍艷蓮, 湯亮, 劉小軍, 張文宇, 曹衛(wèi)星, 朱艷. 基于形態(tài)特征參數(shù)的稻穗幾何建模及可視化研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(4): 1190-1196.

Wu Y L, Tang L, Liu X J, Zhang W Y, Cao W X, Zhu Y. Architectural parameter-based geometric modeling and visualization of rice panicle[J]., 2009, 42(4): 1190-1196. (in Chinese with English abstract)

[53] 葉衛(wèi)軍, 胡時(shí)開(kāi), 李媛媛, 馬伯軍, 郭龍彪. 水稻種質(zhì)資源的分子鑒定和育種利用[J]. 分子植物育種, 2013, 11(4): 625-633.

Ye W J, Hu S K, Li Y Y, Ma B J, Guo L B. Molecular identification and breeding application of rice germplasm[J]., 2013, 2013, 11(4): 625-633. (in Chinese with English abstract)

[54] 蘇德文, 鄭燕梅, 何煒, 張建福, 謝華安. 水稻簇生穗突變體基因研究進(jìn)展[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 28(9): 931-937.

Su D W, Zheng Y H, He W, Zhang J F, Xie H A. Progress on the genes of rice clustered spikelets() mutant[J]., 2013, 28(9): 931-937. (in Chinese with English abstract)

[55] Matsui M. F-box proteins of plants and their various roles[J]., 2012, 84(6): 432-439.

[56] 賈鳳娟. 擬南芥F-box基因調(diào)節(jié)鹽脅迫抗性的分子機(jī)理[D]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

Ja F J. Molecular mechanism of the regulation of salt stress resistance by F-box genein[D]. Shandong Agricultural University, 2015. (in Chinese with English abstract)

[57] 盧寰, 時(shí)振英. 水稻穗發(fā)育的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2013, 49(2): 111-121.

Lu H, Shi Z Y.Molecular research progress of rice panicle development[J]., 2013, 49(2): 111-121. (in Chinese with English abstract)

[58] You X, Zhu S, Zhang W, Zhang J, Wang C M, Jing R N, Chen W W, Wu H Q, Cai Y, Feng Z M, Hu J L, Yan H Q, Kong F, Zhang H, Zheng M, Ren Y L, Lin Q B, Cheng Z J, Zhang X, Lei C L, Jiang L, Wang H Y, Wan J M.regulates rice spikelet development through modulating jasmonic acid biosynthesis[J]., 2019, 224(2): 712-724.

[59] Zhang W, Sheng J, Xu Y, Xiong F, Wu Y F, Wang W L, Wang Z Q, Yang J C, Zhang J H. Role of brassinosteroids in rice spikelet differentiation and degeneration under soil-drying during panicle development[J]., 2019, 19(1): 409.

[60] 劉擁海, 俞樂(lè), 丁君輝, 王若仲, 黃志剛, 蕭浪濤. 植物激素對(duì)分枝發(fā)育的協(xié)同調(diào)控作用研究進(jìn)展[J].植物生理學(xué)報(bào), 2012, 48(10): 941-948.

Liu Y H, Yu L, Ding J H, Wang R Z, Huang Z G, Xiao L T. Research progress in synergistic regulatory roles of phytohormones in shoot branching[J]., 2012, 48(10): 941-948. (in Chinese with English abstract)

[61] Wang Y, Shang L, Yu H, Zeng L Q, Hu J, Ni S, Rao Y C, Li S F, Chu J F, Meng X B, Wang L, Hu P, Yan J J, Kang S J, Qu M H, Lin H, Wang T, Wang Q, Hu X M, Chen H Q, Wang B, Gao Z Y, Guo L B, Zeng D L, Zhu X D, Xiong G S, Li J Y, Qian Q. A strigolactone biosynthesis gene contributed to the green revolution in rice[J].2020, 13(6): 923-932

[62] 王玫, 陳洪偉, 王紅利, 劉克鋒. 獨(dú)腳金內(nèi)酯調(diào)控植物分枝的研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2014, 41(9): 1924-1934.

Wang M, Chen H W, Wang H L, Liu K F.Research progress in regulatory role of strigolactones in shoot branching[J].2014, 41(9): 1924-1934. (in Chinese with English abstract)

[63] Wang L, Sun S, Jin J,Fu D B, Yang X F, Weng X Y, Xu C G, Li X H, Xiao J H, Zhang Q F. Coordinated regulation of vegetative and reproductive branching in rice[J]., 2015, 112(50): 15504-15509.

Location and Candidate Gene Analysis of Rice Clustered Spikelets Gene

LIU Wei, LU Zhanhua, LU Dongbai, WANG Xiaofei,WANG Shiguang, XUE Jia, HE Xiuying*

(Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of New Technology in Rice Breeding, Guangzhou 510640, China;*Corresponding author, E-mail: xyhe@163.com)

【】The mapping and candidate gene analysis of rice clustered spikelet genes helpclone the functional genes for clustered spikelet caused by shortening of the branch length in the process of panicle development. 【】A stable clustered spikelet mutantwas obtained through the spacemutationbreedingtechnique with Yuenongsimiao, a good quality rice cultivar in Guangdong Province as material. F1and F2mapping populations were constructed by crossingwith Yuejinyinzhan. The clustered spikelet genewas mapped and candidate genes were predicted and evaluated by combining with transcriptome sequencing. 【】Genetic analysis showed that the trait was controlled by a pair of semi-dominant gene. The gene was mapped to an interval about 416kb on chromosome 6 by Bulked Segregant Analysis(BSA). Furthermore,was selected as the best candidate gene through expression profiling analysis, RNA-seq, gene sequence differences analysis and qRT-PCR verification. A 9 bp insertion mutation in the 5'-UTR region of this gene suggests that it may regulate transcription or translation process through secondary structural changesand participating in the differentiation of stems during the development of young panicle of rice. 【】It will lay a theoretical foundation for analyzing the shortening mechanism of secondarybranches and spikelet peduncle length.

spacemutation; spikelet cluster; gene mapping; transcriptome sequencing; candidate gene

10.16819/j.1001-7216.2021.0604

2020-06-10；

2020-08-06。

廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（2019KJ105）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2017YFD0100102）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2017A030313183）；科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（高水平農(nóng)科院建設(shè)）；優(yōu)質(zhì)稻良種重大科研聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（粵財(cái)農(nóng)[2019]73號(hào)）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域項(xiàng)目(2018B020206002)。