鄧雪梅 胡鵬 王月影 文藝 譚義青 伍豪 吳凱雄 王俊格 侯琳琳 朱黎欣 朱麗 陳光 曾大力 張光恒 郭龍彪 高振宇 任德勇 錢前 胡江

水稻粒寬突變體的鑒定與基因定位

鄧雪梅1,#胡鵬1,#王月影1文藝1譚義青1伍豪2吳凱雄1王俊格1侯琳琳1朱黎欣1朱麗1陳光1曾大力1張光恒1郭龍彪1高振宇1任德勇1錢前1,*胡江1,*

(1中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006;2廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室, 南寧 530007;#共同第一作者;*通信聯(lián)系人, E-mail: qianqian188@hotmail.com; hujiang588@163.com)

【】水稻粒形是影響水稻產量和決定稻米外觀品質的主要性狀之一。篩選和鑒定新的粒形突變材料，可為研究水稻籽粒發(fā)育的調控機制奠定基礎。粳稻品種中花11經1%的EMS處理，在誘變群體中獲得一份窄粒突變體()；分析粒形和其他主要農藝性狀，在掃描電鏡下觀察穎殼細胞變化；利用突變體與秈稻品種臺中本地1號配組的F2分離群體，選擇隱性個體完成基因的精細定位；開展生物信息和測序分析，確定定位區(qū)間的候選基因；采用RT-PCR分析該基因在根、莖、葉、鞘、穗等組織中的表達模式及其他粒形相關基因的表達水平。與野生型相比，除了表現(xiàn)窄粒外，的粒長、千粒重、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)等顯著下降；掃描電鏡發(fā)現(xiàn)的穎殼內外表皮細胞均小于野生型；遺傳分析表明該窄粒表型受一對單隱性核基因控制；通過開發(fā)的新標記最終將該基因定位在第4染色體BS6與EX49兩個標記之間約31.74 kb的范圍內；測序結果發(fā)現(xiàn)在基因編碼區(qū)發(fā)生了一個由G至A的單堿基突變，導致原來編碼的甘氨酸變成了天冬氨酸；qRT-PCR結果表明，主要在幼穗中表達，且在突變體中表達顯著下降。主要調控水稻粒寬的發(fā)育，預測為其候選基因。這為進一步豐富粒形的遺傳調控網絡打下了基礎。

水稻；粒形；粒寬；基因定位；外觀品質

水稻是全世界主要的糧食作物之一。保證水稻高產、穩(wěn)產、優(yōu)質一直是水稻育種學家的研究重點。水稻的產量主要由有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)以及千粒重三個要素共同決定。其中，籽粒的大小和形態(tài)既決定著千粒重的大小，也決定著稻米的外觀品質[1]。

水稻是禾本科的模式作物，而作為產量性狀的粒形也越來越受到分子生物學家的重視。到目前為止，已經定位了多個與粒形相關的QTL/基因，在水稻的12條染色體上均有分布，其中已克隆的基因超過70個。這些基因大多表現(xiàn)為一因多效，并與其他粒形相關基因協(xié)同表達，進而構成遺傳調控網絡[2]。其中，涉及泛素介導的蛋白酶體降解途徑的基因有、/、/、和等[3-7]；參與G蛋白信號傳導途徑的有、、和等[8-11]；與促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)MAPK途徑有關的有、、和等[12-14]；轉錄因子也是一類調控粒形發(fā)育的重要作用因子，相關的基因包括、/、、/、、、、和等[15-23]；而小分子RNA則通過對靶基因的表達調控參與粒形的發(fā)育[24-27]，如、、和等。此外，、/[1]、/、、/和/等基因也都參與調控粒形[28-32]。

穎殼細胞的形態(tài)、大小和數(shù)量是決定水稻籽粒形態(tài)的重要決定因子，其中MAPK、G蛋白、泛素蛋白酶體以及植物激素途徑都是通過調控細胞的擴增來調控粒形，而MAPK、G蛋白和泛素蛋白酶體途徑還可通過促進細胞增殖來調控籽粒大小。其中，控制粒長的基因主要有[8]、[16]、[23]、/和等[33-36]；控制粒寬的基因主要有[3]、[18]、[1]/等[37, 38]；而控制粒厚的基因有[3]。從對粒形的效應看，[8]、[35]、[3]、/[38]、[36]等基因對粒型具有負調控效應，而[17]、[36]、[18]、[1]、[16]、[34]、[23]等基因則是正調控籽粒的大小。這些為構建水稻種子的理想形態(tài)打下了重要的理論和材料基礎。

本研究在粳稻品種中花11的EMS誘變后代中鑒定出一個窄粒突變體，其主要表現(xiàn)為籽粒寬度下降。利用構建的分離群體和開發(fā)的分子標記，經連鎖分析和染色體步移，最終將該基因精細定位在第4染色體上一個31.74 kb的區(qū)域內，并通過測序找到了差異位點，確定了候選基因。這為豐富粒形的種質資源和進一步解析粒形的遺傳網絡打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

利用EMS對粳稻品種中花11進行誘變，從后代分離群體中篩選到一份粒寬變窄的突變材料，經多代連續(xù)種植，發(fā)現(xiàn)該性狀遺傳穩(wěn)定，我們將其命名為()。利用突變體與秈稻臺中本地1號（TN1）雜交配組，收獲的F1種子自交獲得F2分離群體，再鑒定取樣。所有材料均種植于中國水稻研究所浙江富陽基地和海南陵水南繁基地。

1.2 相關農藝性狀調查與觀察

抽穗后分別調查并統(tǒng)計野生型與的株高、節(jié)間長、分蘗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、粒長、粒寬和千粒重。用作電鏡掃描的籽粒用戊二醇固定再經過磷酸緩沖液充分清洗，然后用1%的鋨酸溶液固定1 h左右，接著用磷酸緩沖液清洗之后用乙醇進行梯度脫水，最后用丙酮處理后進行掃描電鏡觀察（Hitachi H-7650）。

1.3 水稻DNA提取及PCR

野生型和兩個親本、F2群體及混池的DNA提取采用CTAB法。剪取葉片約0.2 g置于2 mL離心管，加入2顆鋼珠和700 μL CTAB，用高通量組織研磨儀破碎組織。65℃下溫育45~60 min，期間震蕩混勻1~2次。取出后在通風櫥中加入500 μL氯仿，蓋上蓋子并上下振蕩搖勻使DNA被充分抽提，12 000下離心8 min，吸取上清液于提前加入500 μL乙醇的1.5 mL離心管中，置于?20℃冷藏2 h以上。最后12 000下離心8 min，棄上清液，晾干沉淀后加入300 μL ddH2O充分溶解DNA備用。引物設計使用Primer Premier 3.0軟件，由尚亞生物技術公司合成。本研究中使用10 μL的PCR擴增體系：2 μL模板DNA，5 μL Mix(2×)，正反向引物各1 μL，1 μL ddH2O。PCR擴增程序：94℃下高溫變性4 min；94℃下預變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，72℃下重復延伸10 min，15℃下保存。共計40個循環(huán)。PCR產物加入溴酚藍核酸染料2.5 μL，1500下離心混勻。瓊脂糖凝膠電泳后置于凝膠成像儀上紫外掃描，保存膠圖并統(tǒng)計分析。

表1 用于基因定位和定量分析的分子標記

1.4 gw4的精細定位

利用與TN1構建的F2分離群體，我們構建了雙親、TN1及其F1和突變型（F2群體中隨機選取30單株）的DNA混池，利用實驗室自有的一套均勻分布于12條染色體的SSR和STS標記，進行多態(tài)性篩選和BSA分析，找出與目的基因連鎖的分子標記。然后擴大群體驗證連鎖標記，確定初定位區(qū)間?；诔醵ㄎ唤Y果，對比目標區(qū)間內秈粳基因組序列，以粳稻日本晴與秈稻9311為參考，找出序列差異后用Primer Premier 3.0軟件設計InDel標記引物(表1)。PCR擴增雙親及F1，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出有多態(tài)性引物對F2群體進行檢測。分析膠圖，將具有TN1帶型的單株記為A，具有帶型的單株記為a，具有F1帶型即交換單株記為H，統(tǒng)計交換單株的減少趨勢及走向，以明確目標基因的區(qū)間。利用NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 和水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/）預測定位區(qū)間內的候選基因，并下載其DNA序列。以候選基因序列為參考，用Primer Premier 3.0軟件設計測序引物，PCR擴增野生型和突變體，并送往尚亞生物技術公司進行測序，最后用軟件Seqman比對分析測序結果。

1.5 實時熒光定量PCR

取野生型與突變體植株的幼穗，使用Axygen公司的Miniprep提取試劑盒提取RNA。隨后用日本TOYOBO公司生產的反轉錄試劑盒（ReverTra Ace quantitative PCR RT Master Mix）反轉合成第1鏈cDNA，實驗操作均按照說明書進行。反轉獲得cDNA后，稀釋4倍用于實時熒光定量PCR。利用(SYBR Green)熒光定量PCR的預混體系和Bio-Rad CFX96 PCR儀，以作為內參，PCR擴增程序如下：95℃下預變性60 s；95℃下變性15 s，60℃下退火15 s，70℃下延伸60 s，共計40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 gw4的籽粒大小

突變體的籽粒顯著小于野生型中花11（圖1-A, B），其中粒長由7.15 mm變?yōu)?.83 mm，減少了4.5%（圖1-D）；粒寬則由3.25 mm減為2.60 mm，減少20%(圖1-E)；長寬比由2.21變?yōu)?.64，增加19.5%（圖1-F）。此外千粒重由34.62 g變?yōu)?7.04 g，減少50.78%（圖1-C）。因此，突變體籽粒主要是粒寬變窄，長寬比增加，使籽粒看上更為細長。

2.2 gw4的植株形態(tài)

除了顯著減少粒寬外，兩者在株高、分蘗、穗長和穗枝梗數(shù)上也存在顯著差異（圖2-A~F）。其中，株高由106.5 cm減少到83.5 cm，植株矮化了21.6%（圖2-G）；分蘗數(shù)由7.3變?yōu)?8.9，與野生型相比增加了158.9%（圖2-H）；倒Ⅰ節(jié)至倒Ⅲ節(jié)的節(jié)間長度分別較野生型減少30.9%、20.5%、29.5%（圖2-C、L）；穗長則由19.1 cm下降到16.32 cm，減少14.55%（圖2-L）；每穗粒數(shù)由198.1降至137.3，下降30.69%（圖2-I）；一次枝梗和二次枝梗數(shù)分別減少28.5%和20.1%（圖2-J、K）。

2.3 gw4籽粒穎殼細胞學觀察

我們對的穎殼進行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)的內穎殼和外穎殼細胞都顯著變?。▓D3-B~E）。其中，中花11和外表皮細胞長分別為98.3 μm和60.4 μm（圖3-F），外表皮細胞寬分別為70.2 μm和46.9 μm（圖3-G），的外表皮細胞長和寬較野生型分別下降38.6%和33.2%，而中花11和內表皮細胞長分別為137.9 μm和114.6 μm（圖3-H），內表皮細胞寬分別為31.5 μm和24.3 μm（圖3-I），其內表皮細胞長和細胞寬分別減少16.9%和22.9%。因此，主要是通過調整細胞大小來調控籽粒發(fā)育的。

2.4 gw4的遺傳分析與精細定位

利用突變體和TN1的配組，F(xiàn)1表現(xiàn)正常，在F2分離群體中發(fā)現(xiàn)野生型與突變型的分離比為3∶1（野生型∶突變型=2181∶969，χ2= 0.96 < χ20.05= 3.84），表明該突變性狀受一對隱性單基因控制。我們利用本實驗室自有的一套SSR和STS標記，通過BSA法對構建的混合池進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)在第4染色體上的分子標記EX49的帶型在混合池中表現(xiàn)為與帶型相似的單帶，而同時F1的雙帶則非常顯著，因此判斷其應該與基因連鎖。我們通過F2群體中51株隱性純合個體確定EX49與緊密連鎖，并將其初步定位在BS6和EX49之間（圖4-A）。通過進一步擴大群體和新發(fā)展分子標記，最終該基因定位在BS18和BS2之間31.74 kb的范圍內（圖4-B），該區(qū)間預測共有6個開放閱讀框（圖4-C）。

A, B?野生型和成熟籽粒，標尺=0.25 cm；C~F圖中誤差值代表標準誤(=13)，**表示0.01顯著水平。ZH11?中花11。

A and B, Mature grain of WT and,bar0.25 cm; C-F, Bars represent standard error(=13). **indicate significant difference between WT andby-test(<0.01). ZH11, Zhonghua 11.

圖1 野生型中花11與突變體的粒形

Fig. 1. Grains size of the wild type Zhonghua 11(ZH11) and its mutant

A, B?植株表型,標尺=20 cm；C?莖稈節(jié)間，標尺=5 cm；D, E, F?穗，標尺=5 cm。G~L中Bar值代表標準誤（n=10），**表示0.01極顯著水平，*表示0.05顯著差異。

Fig. 2. Phenotype of the wild type Zhonghua 11(ZH11) and its mutant

A?穎殼, 標尺=0.25 cm; B和C?穎殼外表皮, 標尺=50 μm; D和E?穎殼內表皮, 標尺=50 μm; Bar值代表標準誤(n=10); **表示0.01顯著水平。

Fig. 3. Glumes of the wild type(ZH11) and its mutant

A?初定位在第4染色體；B?精細定位在31.74 kb的范圍內；C?定位區(qū)間的6個預測基因。

A,was primarily mapped on chromosome 4; B,was narrowed to a 31.74 kb genomic region; C, Total six genes was predicted in this region.

圖4 突變體的精細定位

Fig. 4. Fine mapping of

表2 候選基因分析

2.5 候選基因分析與確定

通過生物學數(shù)據(jù)庫（http://rice.plantbiology.msu. edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search），我們發(fā)現(xiàn)在精細定位31.74 kb的區(qū)間內共含有6個預測基因（圖4-C）。其中，、和均編碼表達蛋白；而編碼蔗糖酶/果膠甲基酯酶抑制劑家族蛋白，其主要在抽穗前和抽穗后的穗、花藥和雌蕊中高表達，而在葉片和籽粒中表達量較低；編碼精氨酸酶，其在葉片、穗、花藥、雌蕊和籽粒中均高表達；則編碼含有赤蘚酸-4-磷酸脫氫酶結構域的蛋白，其主要在幼葉和幼穗中表達，而在花藥、雌蕊及籽粒中表達量極低。為進一步確定候選基因，我們設計引物對精細定位區(qū)間進行擴增和測序，結果發(fā)現(xiàn)突變體在基因編碼區(qū)第4外顯子處發(fā)生了1個單堿基的突變（圖4-C），由G變成A，該堿基突變導致原來編碼的甘氨酸變成天冬氨酸。通過Swiss Model（http://swissmodel.expsay.org）預測，發(fā)現(xiàn)突變后的蛋白結構較野生型蛋白發(fā)生了明顯的改變（圖5）。

2.6 LOC_Os04g01590基因表達分析

為了進一步驗證是否為候選基因，我們對進行了RT-PCR定量表達分析，結果發(fā)現(xiàn)基因在穗中的表達水平顯著下調（圖6-A）。同時開展基因在幼根、葉鞘、劍葉、幼穗和莖稈組織中的表達特異性分析，發(fā)現(xiàn)其主要也在穗中表達（圖6-B），因此推測應為的候選基因。此外，我們還挑選了部分已報道涉及粒寬的基因進行了RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)突變體中、顯著下調和顯著上調表達外，其他粒形相關基因、、、和均未有顯著性差異（圖6-C）。

A, B?GW4蛋白的三維結構；C, D?gw4蛋白的三維結構；B和D為A和C的放大圖；紅框表示蛋白折疊差異位置。

Fig. 5. Three-dimensional structures of proteins GW4 and gw4.

3 討論

籽粒形態(tài)是影響水稻產量和決定稻米外觀品質的主要性狀之一。由于細長形籽粒有利于后期的灌漿，從而更容易產生優(yōu)質的稻米，據(jù)此育種家已經培育出了擁有秈稻外觀的優(yōu)質長粒粳水稻。本研究從中花11的EMS誘變群體中鑒定出了一個可以顯著減少粒寬、增加長寬比的突變體，并通過圖位克隆法將其編碼基因精細定位在31.74 kb的范圍內。測序發(fā)現(xiàn)定位區(qū)間內的基因在第4外顯子處發(fā)生了一個G至A的單堿基替換，該堿基突變導致由原來編碼的甘氨酸變成天冬氨酸（圖4-C），其對應的蛋白三維結構也發(fā)生了明顯變化（圖5），因此該突變很可能是通過影響蛋白折疊而影響了酶的活性。Ma等報道了一個精氨酸酶編碼基因/，其主要作用于尿素循環(huán)催化精氨酸水解成尿素和鳥氨酸，該基因功能缺失突變體則表現(xiàn)為株高降低、籽粒變小和育性下降等，并且結實率和籽粒大小會隨著氮肥的增加而有所恢復[39]。的基因突變使編碼蛋白提前終止，而本研究中蛋白只發(fā)生了一個氨基酸的改變，且在中的表達水平也顯著下降，因而我們推測應為的弱等位變異。

A?LOC_Os04g01590在中花11（ZH11）和gw4中的表達分析；B?LOC_Os04g01590在不同組織中的相對轉錄水平；C?粒形相關基因的表達分析。將ZH11的穗中的轉錄水平設置為1.0，Bar值表示3個生物學重復的平均值±SD；**表示0.01極顯著水平。

Fig. 6. Expression analysis ofandgrain shape genes.

目前，已有多個水稻粒形相關基因的報道，他們的籽粒形態(tài)發(fā)育大多都是通過調控細胞生長完成的。針對穎殼的掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)，其外表皮和內表皮的細胞長較野生型分別下降了38.6%和16.9%，細胞寬則下降了33.2%和22.9%，因此，主要是通過控制細胞的大小來調控粒寬的。在的背景下，我們進一步對基因和其他粒形相關基因進行了RT-PCR分析，結果發(fā)現(xiàn)、、和的表達水平發(fā)生了顯著性的變化。其中[1]正調控籽粒長度、[18]則負調控粒長和粒寬，而[8]也是負調控粒長的，但這些結果并不能很好地解釋降低粒寬的表型，因此推測應該還介導了其他基因來調控細胞的發(fā)育。此外，/的表達水平在突變體背景下發(fā)生了顯著下降，結合的窄粒表型，我們推測應該是粒寬的負調控因子。

水稻是單子葉的模式作物，近20年來以水稻為材料的分子生物學研究得到了長足的發(fā)展。其中通過各種誘變方法構建了多個突變體庫，獲得了大量的突變材料。盡管這些突變體在農業(yè)生產上往往存在著缺陷而無法直接使用，然而通過基因功能操作，如敲除或過表達卻能夠增加目標性狀值，特別是近年來發(fā)現(xiàn)許多無法利用的突變基因，其弱等位卻在生產上大范圍使用，如甬優(yōu)秈粳雜交稻中的粗稈大穗基因[40]和華占中的多蘗矮稈基因/[41]等。因此，開展水稻粒形相關基因的定位與克隆，對豐富籽粒發(fā)育的分子調控網絡，開展分子選擇育種具有重要的意義。

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Identification and Fine Mapping of a Grain Width Mutantin Rice

DENG Xuemei1, #, HU Peng1, #, WANG Yueying1, WEN Yi1, TAN Yiqing1, WU Hao2, WU Kaixiong1, WANG Junge1, HOU Linlin1, ZHU Lixin1, ZHU Li1, CHEN Guang1, ZENG Dali1, ZHANG Guangheng1, GUO Longbiao1, GAO Zhenyu1, REN Deyong1, QIAN Qian1,*, HU Jiang1, *

(1State Key Laboratory of Rice Biology, China Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Laboratory, Nanning 530007, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: qianqian188@hotmail.com; hujiang588@163.com)

【】Grain size is an important agronomic trait that determines yield and appearance quality in rice.Screening and identification of new grain size mutants will lay a foundation for further study of the regulation mechanism of grain development. 【】A grain width mutant（）was obtained from 1% EMS mutagenized population of Zhonghua 11. The scanning electron microscope analysis of the outer and inner surfaces cells of glumes was carried out, and grain size and other agronomic traits were measured at the heading and maturity stages, respectively. With the map-based cloning, the mutant individuals derived from F2population ofand TN1 were used for fine mapping. The candidate gene was determined by gene sequencing based on bioinformatics analysis, and expression analysis of grain size-related genes was carried out by the RT-PCR.】Besides narrow grains,also showed decreased phenotype values in plant height, grain length, thousand grain weight, grain number, number of primary and secondary rachis branches. Scanning electron microscope observation presented that both cell length and width of inner and outer surfaces cells of glumes were smaller than the wild type. Genetic analysis showed that the narrow grain phenotype was regulated by a single recessive nuclear gene, which was fine mapped to a region of 31.74 kb between the two markers BS6 and EX49 on chromosome 4. Sequence analyses revealed a single base substitution of G to A was found inwhich resulted in a substitution of glycine to aspartic acid, and RT-PCR analysis indicated that it was mainly expressed in young panicles with declined expression level in mutant as compared with the wild type.【】is mainly involved in grain width development, and its candidate gene should be, which lays a foundation for further perfecting the genetic regulatory network of grain size.

rice; grain size; grain width; gene mapping; appearance quality

10.16819/j.1001-7216.2021.01204

2020-06-10;

2020-08-06。

浙江省自然科學基金杰出青年項目(LR19C130001); 國家自然科學基金資助項目(31871594, 91335105); 廣西省自然科學基金青年科學基金資助項目(2018GXNSFBA050058)。