方芳，李寧，徐春麗，楊繼紅*，鄭志昌*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，貴州 貴陽 550001；2.中國藥科大學(xué)，藥學(xué)國家實驗教學(xué)示范中心，江蘇 南京 211198)

近年來，隨著革蘭陽性菌多重耐藥的問題日益突出。特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的檢出率逐年增加。一項在54個國家222家醫(yī)院開展的多中心臨床試驗表明，各個國家由MRSA引起的肺炎的總發(fā)生率為3.0%(亞洲為7.4%)[1]。萬古霉素(vancomycin，VAN)是一類三環(huán)糖肽類抗菌藥物，在臨床上是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)和腸球菌等引起的重癥感染的首選藥物[2]。然而，由于萬古霉素的治療窗較窄，最低有效濃度與中毒濃度較為接近，因此一個可靠的萬古霉素血藥濃度監(jiān)測方法對保證用藥安全有效具有十分重要的意義。

目前，在萬古霉素的治療藥物監(jiān)測(TDM)中最常用的是熒光偏振免疫分析法(FPIA)及高效液相色譜法(HPLC)。FPIA的樣品制備過程較為簡單，但其儀器設(shè)備及檢測試劑較貴，會增加患者的經(jīng)濟負擔(dān)[3]。HPLC常規(guī)用于生物樣本中目標物的檢測，具有較高的靈敏度、準確度和精密度，但用紫外檢測器(UV)時分析時間較長，這大大限制了HPLC在臨床中的應(yīng)用。UHPLC法[4-6]是在HPLC法基礎(chǔ)上開發(fā)能夠耐受高壓的新型色譜分析技術(shù)，其運行粒徑低于2 μm，相比于傳統(tǒng)的HPLC法，它提高了檢測靈敏度及分離效果，減少了采血量，縮短了分析時間，大大提高了檢測效率，對于臨床血藥濃度監(jiān)測更為有利。某些研究比較了FPIA 與 UHPLC兩種檢測方法[7-8]，表明兩種方法的萬古霉素血藥濃度檢測值沒有明顯的差異。但其中一項研究發(fā)現(xiàn)[8]，在低濃度時，UHPLC的準確度更高。并且，Wilson等[9]發(fā)現(xiàn)在檢測中FPIA的專屬性令人不太滿意。因此UHPLC更適用于萬古霉素的血藥濃度監(jiān)測。然而目前很少有研究報道UHPLC-UV應(yīng)用于萬古霉素的TDM。因此，建立一個快速、簡便、可靠地UHPLC-UV用于測定萬古霉素血藥濃度，以便用于臨床常規(guī)的TDM是必要的。

重癥監(jiān)護病房(ICU)患者由于病情復(fù)雜，大多具有年齡偏大、合并疾病較多、肝腎功能不全、聯(lián)合用藥等特點，導(dǎo)致萬古霉素在患者體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)發(fā)生變化，出現(xiàn)個體差異[10]。本研究將對ICU中腎功能不全的患者及潛在腎功能不全的老年患者進行血藥濃度監(jiān)測，探討萬古霉素血藥峰谷濃度與臨床療效及安全性的相關(guān)性，以驗證國內(nèi)外指南對萬古霉素血藥濃度范圍的推薦是否適合中國人，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 萬古霉素標準品(批號：C17900500)及去甲萬古霉素標準品(批號：30338-200303，內(nèi)標)購買于中國藥品生物制品檢定所(純度>99%)。乙腈(色譜純)購買于Merck公司。其他試劑如磷酸二氫鉀、高氯酸、磷酸、三乙胺為分析純。

1.2 色譜條件 Waters Acquity H-Class UPLC 超高效液相色譜儀，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈：0.005 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液(含0.1%三乙胺，磷酸調(diào)pH 3.4)(流動相洗脫程序為0～0.5 min為7%乙腈，0.5～3 min乙腈升至12%，3～3.1 min乙腈升至98%，3.1～4 min維持98%乙腈，4～4.1 min 乙腈降至7%，4.1～6 min 維持7%乙腈)，柱溫為40 ℃，流速為0.3 mL·min-1，檢測波長為210 nm，進樣量為10 μL，檢測器為二級陣列檢測器(PDA)，整個分析時間為6 min。

1.3 儲備液、標準曲線及質(zhì)控樣品的配制 萬古霉素(600 mg·L-1)及去甲萬古霉素(800 mg·L-1)儲備液用超純水制備并儲存于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?超純水由Milli-Q Millipore系統(tǒng)制備)。25～600 mg·L-1的萬古霉素標準工作液按照逐級稀釋法用蒸餾水制備。取適量人空白血清加入萬古霉素標準工作液以制備2.5、5、10、25、50、120 mg·L-1不同濃度的標準曲線及4、20 及60 mg·L-1的質(zhì)控樣品。

1.4 樣品制備 取100 μL血清樣品加入10 μL內(nèi)標液(800 mg·L-1去甲萬古霉素)，加入10%高氯酸25 μL沉淀血清中蛋白，渦旋2 min，16 000 r·min-14 ℃離心10 min獲得上清液，取10 μL上清液進樣。

1.5 方法學(xué)驗證 根據(jù)原國家食品藥品監(jiān)督管理局及歐洲醫(yī)藥局推薦，該檢測方法以專屬性、批內(nèi)、批間精密度、準確度、穩(wěn)定性、回收率進行方法學(xué)驗證。取6份人空白血清做專屬性驗證，穩(wěn)定性實驗在不同儲存條件下進行：樣品處理前室溫放置12 h，樣品處理后4 ℃放置24 h，-80 ℃下放置2個月以測定長期穩(wěn)定性?；厥章室匀f古霉素質(zhì)控樣品中的峰面積除以相應(yīng)濃度萬古霉素的標準水溶液獲得。

1.6 萬古霉素的臨床應(yīng)用

1.6.1 一般資料 選擇2017年9月至 2018年9月我院ICU病房收治的使用萬古霉素治療的感染患者。納入標準:①藥物敏感試驗提示對萬古霉素敏感； ②萬古霉素療程>3 d；③65歲以下伴腎功能不全，即肌酐清除率(CCr)<50 mL·min-1的患者；④65歲及65歲以上的老年患者。排除標準:①預(yù)防用藥者；②患者及家屬不愿意配合者。

1.6.2 萬古霉素血藥濃度測定時間 萬古霉素靜脈滴注時藥代動力學(xué)呈二房室模型，腎功能正常者，萬古霉素的半衰期為 4～6 h;而腎功能不全者，平均消除半衰期為7.5 d[11]。經(jīng)4～5個半衰期可達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。根據(jù)2009年美國藥師協(xié)會、美國感染疾病協(xié)會和美國感染病藥師協(xié)會聯(lián)合發(fā)布的《萬古霉素治療成人金黃色葡萄球菌感染的治療監(jiān)測實踐指南》[12]，2011年《萬古霉素臨床應(yīng)用中國專家共識》[13]，2016年《萬古霉素臨床應(yīng)用劑量中國專家共識》[14]，推薦萬古霉素血清峰濃度應(yīng)在達穩(wěn)態(tài)并靜脈滴注結(jié)束后 30 min 留取，血清谷濃度則在達穩(wěn)態(tài)后給藥前 30 min 留取，并推薦谷濃度的監(jiān)測應(yīng)在第四或第五劑給藥前進行。因此，本研究擬在第四次給藥后30 min及第五次給藥前30 min用EDTA管抽取患者靜脈血3 mL，用以測定萬古霉素的峰濃度及谷濃度。所有血清樣品儲存于-80 ℃直到分析測定。

1.6.3 療效評價 萬古霉素用藥結(jié)束時判斷其療效。療效判斷標準參照原衛(wèi)生部 2010 年的《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》分為:①痊愈:癥狀、體征、實驗室數(shù)據(jù)、病原學(xué)檢查均恢復(fù)正常;②顯效:以上指標有 1 項未完全恢復(fù)正常;③進步:用藥后病情有所好轉(zhuǎn)，但不十分明顯;④無效:用藥 72 h 后，病情無明顯好轉(zhuǎn)或加重。

1.6.4 安全性評價 根據(jù)注射用鹽酸萬古霉素的說明書，萬古霉素常見不良反應(yīng)為腎、耳毒性，并提示嚴重肝腎功能不全者禁用。由于本文的研究對象為ICU患者，大部分為昏迷狀態(tài)，因此本文主要通過肝腎功能來進行安全性評價。以藥物性肝損傷標準來評價萬古霉素的肝損傷，使用萬古霉素治療后，至少2～3次連續(xù)監(jiān)測到血清肌酐水平上升，且絕對值上升44.2 μmol·L-1或升高值大于或等于基線水平的50%(以最高值為準)判斷為發(fā)生腎毒性[10]。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 專屬性 選取6名一周內(nèi)未服用任何藥物的健康志愿者以獲得人空白血清，精密量取空白血清與含藥血清按“4樣品制備”項下處理后測定得萬古霉素血藥濃度色譜圖(見圖1)，樣品峰及內(nèi)標峰的保留時間分別為1.91 min及1.58 min。結(jié)果表明萬古霉素在該條件下分離度高、峰形較好，樣品峰與內(nèi)標峰未受其他雜質(zhì)峰影響。且高濃度樣品對低濃度樣品沒有明顯的殘留效應(yīng)。

2.1.2 標準曲線 精密量取空白血清90 μL于EP管中，加入萬古霉素標準溶液，混勻，使其成為濃度分別為2.5、5、10、25、50、120 mg·L-1的溶液，按“4樣品制備”項下處理后進樣測定，以萬古霉素峰面積(Ai)對內(nèi)標峰面積(As)的比值為縱坐標(Y)，以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.012 5X+0.010 3(r2=0.999 5)。血清中萬古霉素定量下限為2.5 mg·L-1，萬古霉素在2.5～120 mg·L-1線性關(guān)系良好，預(yù)期可覆蓋萬古霉素人體血藥濃度。

2.1.3 準確度及精密度 精密量取空白血清90 μL，加入萬古霉素標準溶液，制備成濃度分別為4、20、60 mg·L-1的樣品，每一質(zhì)量濃度均制備5份樣品，按“4樣品制備”項處理測定，連續(xù)測定3 d，評價該方法的精密度、準確度。如表1所示，質(zhì)控樣品的準確度及批內(nèi)、批間精密度的RSD值均在15%內(nèi)，滿足生物樣品測定的要求。

A.空白血清(紅色)及定量下限(黑色)；B.含藥血清(500 mg·L-1萬古霉素及800 mg·L-1內(nèi)標)；C.患者暴露于萬古霉素后血清圖1 色譜圖

表1 UHPLC測定萬古霉素血藥濃度的準確度及批內(nèi)、批間變異(n=5)

2.1.4 回收率 配制低、中、高(4、20、60 mg·L-1)3種血清樣品，每種濃度5份；同濃度又以超純水為基質(zhì)配制3份，按“4樣品制備”項處理后檢測，以峰面積比值計算低、中、高濃度絕對提取回收率，分別為94.90%、97.70%、101.16%，說明用高氯酸沉淀蛋白能得到較高的回收率。

2.1.5 不同儲存條件下的穩(wěn)定性 根據(jù)臨床實際情況來設(shè)置處理前、處理后穩(wěn)定性及長期穩(wěn)定性試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 萬古霉素在不同條件下的穩(wěn)定性(n=5)

未處理的質(zhì)控樣品(4、20、60 mg·L-1)室溫放置12 h后測定,其平均準確度分別為96.78%、99.36%、100.78%，處理后樣品放置于進樣盤中24 h后測定，其平均準確度分別為114.16%、103.47%、104.68%，血樣放置于-80 ℃冰箱2個月后測定，萬古霉素沒有明顯的降解，其平均準確度分別為114.35%、99.79%、97.89%。表明該方法萬古霉素在不同儲存條件下的穩(wěn)定性良好。

2.2 萬古霉素UPHLC-UV測定法的臨床應(yīng)用 在ICU患者中收集到符合入組條件的腎功能不全或老年患者共28例。其血清峰谷濃度測定值及療效和肝腎毒性情況如表3所示。經(jīng)UHPLC-UV測定，其血清峰谷濃度分別為15.42～89.12 mg·L-1(峰濃度) 及 7.30～55.46 mg·L-1(谷濃度)，說明本文所建立的測定方法能滿足臨床測定要求。

表3 患者萬古霉素血清濃度測定結(jié)果及療效與安全性

2.2.1 血清峰谷濃度與臨床療效相關(guān)性 本研究監(jiān)測28例使用萬古霉素的ICU患者，其中1例痊愈，12例顯效，11例進步，4例無效。將療效無效、進步、顯效、痊愈分別打分為0、1、2、3，以Spearman進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r絕對值在0.0～0.2為極弱相關(guān)或無相關(guān)，0.2～0.4為弱相關(guān)，0.4～0.6為中等程度相關(guān)，0.6～0.8為強相關(guān)，0.8～1.0為極強相關(guān)。發(fā)現(xiàn)血清峰濃度與療效的Spearman相關(guān)系數(shù)r值為0.442 9(P為0.099 2)，谷濃度與療效的Spearman相關(guān)系數(shù)r值為0.178 7(P為0.362 9)，說明血清峰濃度與療效有中等程度相關(guān)性，血藥谷濃度與臨床療效無明顯相關(guān)性。

2.2.2 血清峰谷濃度與肝腎毒性相關(guān)性 28例患者用藥期間有6例發(fā)生腎毒性，其中2例用藥前輕度腎功能不全，有6例發(fā)生肝毒性，其中4例在用藥前肝功能異常，以Spearman相關(guān)性分析，分別對血清峰谷濃度與肝腎毒性進行相關(guān)性評價，用藥后未發(fā)生肝、腎毒性及發(fā)生肝、腎毒性分別打分為0及1，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)谷濃度與發(fā)生肝、腎毒性的Spearman相關(guān)系數(shù)r值分別為-0.010 8(P為0.956 6)及0.377 2(P為0.047 9)，說明血清谷濃度與肝毒性無明顯相關(guān)性，與腎毒性有弱相關(guān)性且有統(tǒng)計學(xué)意義，血清峰濃度與發(fā)生肝、腎毒性的Spearman相關(guān)系數(shù)r值分別為0.115 7(P為0.734 1)、0.418 7(P為0.137 7)說明血清峰濃度與肝毒性無相關(guān)性，但與腎毒性有中等程度相關(guān)性但無統(tǒng)計學(xué)意義。

發(fā)生腎毒性組(n=6)與未發(fā)生腎毒性組(n=22)患者的血清谷濃度分別為(36.08 ± 10.23)mg·L-1、(19.66 ± 11.13)mg·L-1，兩組間有極顯著性差異(P=0.005)，如表4所示。從表3可看出發(fā)生腎毒性最低谷濃度為24.85 mg·L-1。兩組間血清峰濃度分別為(50.77 ± 27.51)mg·L-1、(29.82 ± 10.50)mg·L-1，兩組間有顯著性差異(P=0.04)，發(fā)生腎毒性組最低峰濃度為29.23 mg·L-1。發(fā)生肝毒性組(n=6)與未發(fā)生肝毒性組(n=22)患者的血清峰谷濃度比較，無統(tǒng)計學(xué)差異。

表4 萬古霉素血清峰谷濃度與肝腎毒性的情況

3 討論

本研究建立了一個具有高度選擇性、高靈敏度、快速的UPHLC-UV法來測定人血清中萬古霉素的濃度，并通過專屬性、準確度、精密度、回收率、穩(wěn)定性等進行方法學(xué)驗證。通過對臨床選取的樣本進行測定，說明該測定法能應(yīng)用于臨床作為萬古霉素的TDM，可及時有效的測定萬古霉素的血藥濃度。

目前，在萬古霉素的血藥濃度測定方法中，曾經(jīng)報道的有經(jīng)過液液提取[7-8,15]或固相萃取[16-18]后用HPLC-MS/MS進行測定。然而，在樣品處理方法中，液液提取法耗時長，且提取回收率并不理想，重復(fù)性較差。利用固相萃取柱(SPE柱)來處理樣品需經(jīng)過SPE柱的預(yù)活化-上樣-有機溶劑洗脫-目標洗脫液收集-揮發(fā)及濃縮等操作，步驟較為煩瑣，時效較低，且SPE小柱成本較高。廣泛應(yīng)用于生物樣品處理的甲醇或乙腈直接沉淀蛋白法較為簡單、快速，但存在萬古霉素被有機溶劑稀釋的問題，用紫外檢測器無法檢測到低濃度樣品。本研究采用10%高氯酸沉淀蛋白，可獲得澄清的上清液，且對萬古霉素?zé)o明顯的稀釋作用，可直接用紫外檢測器檢測，線性范圍可以完全覆蓋臨床血清樣本中的萬古霉素。

在波長的選擇上，HPLC測定法中236,230,215 nm均有報道過[8，16]，通過UV檢測器掃描萬古霉素的最大吸收峰在210 nm處，因此本研究的測定波長設(shè)置為210 nm。另外，在流動相的優(yōu)化上，通過加入0.1%的三乙胺到磷酸二氫鉀緩沖液中以避免峰拖尾，再用磷酸調(diào)磷酸二氫鉀緩沖液的pH值到3.4以獲得萬古霉素及內(nèi)標的對稱度較高的窄峰，萬古霉素的保留時間為1.91 min，溶劑峰不影響其檢測。

既往研究推薦萬古霉素血藥谷濃度應(yīng)維持在5～10 mg·L-1[3]。但隨著近年來萬古霉素的廣泛應(yīng)用，中度耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(VISA)和異形萬古霉素中敏金黃色葡萄球菌(hVISA)的發(fā)現(xiàn)，2009年美國藥師協(xié)會、美國感染疾病協(xié)會和美國感染病藥師協(xié)會聯(lián)合發(fā)布的《萬古霉素治療成人金黃色葡萄球菌感染的治療監(jiān)測實踐指南》[12]，2011年我國的《萬古霉素臨床應(yīng)用中國專家共識》[13]，隨后2016年我國出臺的《萬古霉素臨床應(yīng)用劑量中國專家共識》等資料[14]，均建議將萬古霉素血藥谷濃度提高至10～20 mg·L-1，以避免耐藥菌的發(fā)生。對 MRSA 引起的復(fù)雜及重癥感染(如血流感染、腦膜炎、重癥肺炎及感染性心內(nèi)膜炎等)建議將谷濃度維持在15～20 mg·L-1，以保證臨床療效。因此本研究最低檢測限為2.5 mg·L-1能滿足臨床檢測要求。在臨床的樣本測定中，本研究設(shè)置的線性范圍也符合臨床實際需求。

在臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)血清谷濃度與臨床療效無相關(guān)性，但與腎毒性有弱相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r為0.377 2)且有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究還發(fā)現(xiàn)血清谷濃度的影響主要來自患者的腎功能，腎功能不全的患者暴露于萬古霉素后可能會更快發(fā)生腎毒性，與呋塞米、甘露醇等易致腎損害的藥物合并使用，使用萬古霉素后發(fā)生腎毒性的風(fēng)險增加。這與文獻報道一致[10,21-22]。本研究中發(fā)生腎毒性患者的最低谷濃度為24.85 mg·L-1，這與一篇文章指出的萬古霉素中毒濃度(>25 mg·L-1)基本一致[7]，說明在ICU患者中，一個安全的谷濃度范圍較窄，腎功能不全患者需要及時監(jiān)測谷濃度，一旦發(fā)現(xiàn)谷濃度大于20 mg·L-1時，需調(diào)整給藥劑量或間隔，以保證臨床安全用藥。

本研究中，發(fā)現(xiàn)峰濃度與療效及腎毒性均有中等程度相關(guān)性但無統(tǒng)計學(xué)意義。在一篇研究血藥峰濃度與臨床結(jié)局相關(guān)性系統(tǒng)性評價的文章中[20]，指出血藥峰濃度的高低與臨床療效及腎毒性均無明確證據(jù)證明其有相關(guān)性。因此，說明并不是峰濃度越高，療效越好。

綜上所述，本研究建立的UHPLC-UV萬古霉素測定法具有靈敏，快速，準確，試劑消耗少等特點，適用于臨床作為萬古霉素常規(guī)的治療藥物監(jiān)測和其他相關(guān)研究。

致謝：感謝貴州省科技計劃項目黔科合LH字〔2016〕7255號對本研究的支持。感謝貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床研究中心提供使用超高效液相色譜儀。