曾蘭花，劉瀟瀟，陳漫麗，李華，程常勇

(1.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510630；2.中山大學新華學院，廣東 廣州 510600)

薄荷素油(薄荷油) 為唇形科植物薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)的新鮮莖和葉經水蒸氣蒸餾、冷凍、部分脫腦加工提取的揮發(fā)油，有一種特有的薄荷樣香氣，香氣新鮮、強烈透發(fā)，具有消炎鎮(zhèn)痛[2]、解痙、抗感染[3]、利膽、溶石排石等作用?，F(xiàn)行標準收載于《中國藥典》2015年版(一部)，其含量測定采用毛細管氣相色譜法[1]，以萘為內標，測定薄荷腦的含量，測定成分單一，難以全面評價薄荷素油的內在質量。本研究采用毛細管氣相色譜程序升溫法，以環(huán)己酮為內標，將薄荷素油中各主要成分分離，測定各組分含量。同時建立薄荷素油指紋圖譜，對指紋圖譜中主要色譜峰進行歸屬，以期為進一步完善薄荷素油的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器 日本島津GC-2030氣相色譜儀；日本島津GC-2010AF/FID/ECD氣相色譜儀；Thermo Trace1300 FID+ECD+頂空氣相色譜儀；空氣發(fā)生器AG-1602；氫氣發(fā)生器HG-1803A。色譜柱：HP-INNOWAX(30.0 m×0.25 mm，0.25 μm)；FFAP(30.0 m×0.25 mm，0.25 μm)。

1.2 試劑 環(huán)己酮、無水乙醇、萘、聯(lián)苯、甲醇。

1.3 標準品 薄荷腦(批號：110728-201707，含量為99.8%)、檸檬烯(批號：100470-201302，含量為96.0%)、乙酸薄荷酯(批號：190044-201001，鑒別用)均購于中國食品藥品檢定研究院；(-)-薄荷酮(批號：M158010-5mL，含量>90.0%)購于阿拉丁試劑公司。內標物環(huán)己酮(批號：20190101-1)購于廣州化學試劑廠。

1.4 供試品 批號為181216、190118、190219的樣品，由黃山天目薄荷藥業(yè)有限公司提供；批號為OAY180725、OAY181112、OAY190301、OAY190705、OAY191111的樣品，由安徽豐樂香料有限責任公司提供。

2 試驗方法

2.1 色譜條件 以改性聚乙二醇為固定相的毛細管柱(柱長為30 m，內徑為0.25 mm，膜厚度為0.25 μm)，柱溫為程序升溫：初始溫度60 ℃，保持5 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至125 ℃，保持1 min；再以每分鐘2 ℃的速率升溫至140 ℃，保持2 min；進樣口溫度200 ℃；檢測器溫度250 ℃；分流進樣；分流比10∶1。

2.2 溶液制備

2.2.1 內標溶液的制備 取環(huán)己酮8 g，用無水乙醇溶解稀釋至2 000 mL，作為內標溶液。

2.2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取檸檬烯對照品0.076 74 g、(-)-薄荷酮對照品0.252 68 g、乙酸薄荷酯對照品0.075 86 g、薄荷腦對照品0.405 01 g，至50 mL容量瓶中，用內標溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。(每1 mL含檸檬烯1.473 4 mg、(-)-薄荷酮4.548 2 mg、乙酸薄荷酯1.517 2 mg、薄荷腦8.084 mg)。

2.2.3 混合對照品溶液制備 精密量取對照品儲備液4 mL，置10 mL的容量瓶中，加內標溶液稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含檸檬烯0.589 36 mg、(-)-薄荷酮1.819 30 mg、乙酸薄荷酯0.606 88 mg、薄荷腦3.233 6 mg)。

2.2.4 供試品溶液的制備 稱取本品0.2 g，精密稱定，至25 mL量瓶中，用內標溶液稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，測定，即得。

3 方法與結果

采用氣相色譜法同時測定檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦4個組分的含量[6-8]。具體試驗情況如下：

3.1 準確度試驗 取已知含量的同一批號樣品(批號：190118，含檸檬烯5.8%；(-)-薄荷酮18.0%；乙酸薄荷酯5.8%；薄荷腦31.4%)0.1 g，按照對照品加入量與所取供試品中相應成分含量為1.5∶1、1∶1、0.5∶1左右，分別按供試品溶液制備方法制備高、中、低3個不同濃度的供試品溶液，各3份，共9份，精密稱定，置25 mL容量瓶中，分別加入對照品儲備液2、4、6 mL，加內標溶液稀釋至刻度，搖勻，制成加樣回收供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定,分別計算檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦的回收率。結果檸檬烯的平均回收率為99.0%，RSD為1.3%(n=9)；(-)-薄荷酮的平均回收率為101.4%，RSD為0.6%(n=9)；乙酸薄荷酯的平均回收率為99.9%，RSD為0.5%(n=9)；薄荷腦的平均回收率為97.0%，RSD為1.5%(n=9)。結果見表1，表明該方法的準確度較好。

表1 準確度(加樣回收)試驗結果

3.2 重復性試驗 精密稱取本品(批號：190118)0.2 g，取共6份，按“2.2.4”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，結果：檸檬烯平均含量為6.0%(g·g-1)，RSD為1.5%(n=6)；(-)-薄荷酮平均含量為17.6%(g·g-1)，RSD為1.3%(n=6)；乙酸薄荷酯平均含量為5.9%(g·g-1)，RSD為1.4%(n=6)；薄荷腦平均含量為31.0%(g·g-1)，RSD為1.0%(n=6)。結果表明該方法的重復性良好。

3.3 精密度考察 取“2.2.3”項下制備的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)6次進樣，結果檸檬烯峰面積的RSD為0.4%；(-)-薄荷酮峰面積的RSD為0.4%；乙酸薄荷酯峰面積的RSD為0.3%；薄荷腦峰面積的RSD為0.4%。結果表明儀器精密度良好。

3.4 線性關系考察 取“2.2.2”項下的對照品儲備液各1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL容量瓶中，用內標溶液稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”的色譜條件測定。以進樣量(ng)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪圖得直線，回歸方程如下：

檸檬烯Y=558.4X-10 664(r=0.999 8)；(-)-薄荷酮Y=413.94X-36 306(r=0.999 6)；乙酸薄荷酯Y=444.65X-7 934.1(r=0.999 8)；薄荷腦Y=521.68X-68 500(r=0.999 8)。結果表明：檸檬烯在147.34～1 473.41 ng；(-)-薄荷酮在504.35～5 043.49 ng；乙酸薄荷酯在151.72～1 517.20 ng；薄荷腦在808.40～8 084.00 ng的范圍內呈良好的線性關系。

3.5 耐用性

3.5.1 色譜條件考察 經過對恒溫和程序升溫的多次實驗，因為樣品主要成分較多，發(fā)現(xiàn)程序升溫有利于檸檬烯與桉油精、薄荷腦與胡薄荷酮的分離。所以選擇了“2.1”作為最終的色譜條件(見圖1)。

3.5.2 不同色譜柱及不同色譜儀的考察 取同一份本品溶液(批號：190118)，在不同品牌的聚乙二醇色譜柱上測定以及用同一根氣相色譜柱HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)在不同品牌的氣相色譜儀上測定，分離度均良好，測定結果基本一致，結果無明顯差別(見表2)。

表2 不同色譜柱及不同色譜儀的考察結果

3.5.3 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一份本品溶液(批號：190118)，分別在第0、5、10、15、20、25 h，注入氣相色譜儀中,按“2.1”項下色譜條件進行測定,結果檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦峰面積的RSD分別為2.0%、1.9%、1.9%、1.8%，結果表明供試品在25 h內穩(wěn)定性良好。

1.檸檬烯；2.桉油精；3.薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；5.薄荷腦；6.胡薄荷酮圖1 系統(tǒng)適用性圖譜

3.6 樣品測定 根據(jù)正文制定的方法，按含量測定方法測定，測定了8批薄荷素油里檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦的含量，結果詳見表3。

表3 樣品含量測定結果

4 指紋圖譜

按現(xiàn)行標準進行檢驗，桉油精峰峰面積小，不適合作為參照峰。以檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦為參照峰，建立指紋圖譜，并進行方法學考察，以期為其質量控制提供參考[4-5]。

4.1 重復性試驗 取同一批樣品(批號：190118)，約0.2 g，精密稱定，共6份，按 “2.2.4”項下的方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定。以薄荷腦為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果測得各共有色譜峰的相對保留時間沒有顯著性差異，RSD為0；共有峰的相對峰面積RSD均<3%；采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件進行處理,6份樣品的圖譜與對照圖譜相似度≥0.999，結果表明方法的重復性良好。

4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品(批號：190118)，約0.2 g，精密稱定，按含量測定“2.2.4”項下的方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，分別于0、5、10、15、20、25 h注入氣相色譜儀進行分析，記錄色譜圖。以環(huán)己酮為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果測得各共有色譜峰的相對保留時間RSD<0.1%，共有峰的相對峰面積RSD<5.0%；采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件進行處理，6次進樣的圖譜與對照圖譜相似度均≥0.998，結果表明供試品溶液在25 h內穩(wěn)定。

4.3 不同色譜柱 試驗中考察了2種不同型號的色譜柱：S1:Agilent HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，S2:Agela Technologies DA-FFAP毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。結果采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件進行處理，2份進樣的圖譜與對照圖譜相似度均≥0.998，結果表明供試品溶液在不同型號色譜柱中穩(wěn)定。

4.4 不同儀器 試驗中考察了3種不同品牌型號的氣相色譜儀：S1:Shimadzu GC-2030 氣相色譜儀；S2:Shimadzu GC-2010 氣相色譜儀；S3：Thermo Scientific Trace 1300氣相色譜儀。結果采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件進行處理，3份進樣的圖譜與對照圖譜相似度均≥0.994，結果表明供試品溶液在不同品牌型號的氣相色譜儀中穩(wěn)定。

4.5 樣品測定及色譜峰的化學成分指認 取8批薄荷素油樣品，按照含量測定“2.2.4”項下制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。對所有樣品的色譜圖進行統(tǒng)一積分后，將所得圖譜以AIA格式導入國家藥典委員會研制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件進行處理， 8批AIA格式的色譜圖生成對照圖譜；選擇平均數(shù)法作為對照圖譜的生成方法，時間窗寬度設為0.1，運用多點校正方法對色譜峰進行Mark峰匹配，得到8批樣品 GC 指紋圖譜疊加圖，確定了6個共有峰，通過與對照品比對，指認峰1、2、4、6分別為檸檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷腦?；旌蠈φ掌啡芤?、供試品溶液色譜圖分別見圖2～3。

1.檸檬烯；2.(-)-薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；S.薄荷腦圖2 混合對照品溶液色譜圖

1.檸檬烯；2.(-)-薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；S.薄荷腦圖3 供試品溶液色譜圖

4.6 指紋圖譜的建立及相似度評價

4.6.1 指紋圖譜共有模式的建立 將所得8批薄荷素油GC圖譜以AIA格式依次導入國家藥典委員會研制的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)軟件，確定了除溶劑峰與內標峰以外的6個共有峰，建立了薄荷素油GC 指紋圖譜。

4.6.2 樣品檢驗結果與分析 8批薄荷素油GC指紋圖譜疊加圖(見圖4)，生成對照指紋圖譜，并進行了相似度計算，結果除溶劑峰和內標峰以外，8批供試品的相似度范圍：0.997～0.999；樣品之間的相似度較高，均大于0.90，故8批樣品均符合規(guī)定(見表4)。

圖4 8批薄荷素油GC指紋圖譜疊加圖

表4 8批供試品相似度評價結果

5 討論

本文考察了多種物質作為內標物，其中萘與聯(lián)苯色譜峰保留時間遠大于共有峰保留時間，而環(huán)己酮色譜峰在檸檬烯與(-)-薄荷酮之間，且與樣品中的其他色譜峰均能得到很好的分離，故選擇環(huán)己酮作為本實驗的內標物。完善了薄荷素油現(xiàn)行質量標準。采用多參照峰指紋圖譜結合多組分含量測定的質量評價模式，能更全面地對薄荷素油進行質量控制。

本試驗以薄荷素油《中國藥典》2015年版標準為基礎，修訂了氣相指紋圖譜，標定共有峰6個，指認了其中4 個化學成分，并對4個成分進行了定量檢測。多組分含量測定與指紋圖譜結合，較常規(guī)檢驗和單個成分定量測定，更能全面反映該制劑質量的一致性和穩(wěn)定性，對薄荷素油的質量評價有更積極的意義，為保證臨床用藥的安全性、有效性和穩(wěn)定性提供了方法和依據(jù)。