陳遷 任建兵 黎紅平 王柱 任竹瀟 甘嘉敏 向建文 聶川

BMSCs 是骨髓中一種具有多向分化能力的干細(xì)胞,是骨髓造血微環(huán)境的關(guān)鍵組分,其在體外環(huán)境中的增殖能力很強(qiáng),而免疫應(yīng)答的性能較弱,可以保持原代細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定,尤其是在組織受損的情況下,采用BMSCs 治療可以修復(fù)受損的組織,同時在受損的組織旁分泌血管生成因子、營養(yǎng)因子,以改善血管生成的微環(huán)境,促進(jìn)血管新生［1-3］。Ang-1 以存在血管內(nèi)皮細(xì)胞中為主,在血管生成素受體酪氨酸激酶2(Tie-2)受體的誘導(dǎo)下可以促進(jìn)血管生成和組織修復(fù)等［4,5］。其在缺血和缺氧的環(huán)境中具有較強(qiáng)的耐受性,是促血管生成素的一種類型,可以促進(jìn)血管成熟,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等［6］。本研究通過高氧誘導(dǎo)視神經(jīng)損傷小鼠,給小鼠注射Ang-1 基因轉(zhuǎn)染至BMSCs,觀察Ang-1 基因轉(zhuǎn)染至BMSCs 后對高氧誘導(dǎo)的新生鼠視神經(jīng)損傷模型的協(xié)同保護(hù)作用報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇30 只出生后3 d 的健康小鼠,母鼠同籠,均購自常州卡文斯實驗動物有限公司。幼鼠體重5～20 g,置于安靜、室溫和濕度適宜的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)。造模期間可自由攝食和飲水。將30 只小鼠隨機(jī)分為高氧鹽水組、空白對照組、Ang-1 基因轉(zhuǎn)染至BMSCs 后注射高氧鹽水組(Ang-1+BMSCs 高氧組),每組10 只。

1.2 方法 高氧鹽水組和Ang-1+BMSCs 高氧組小鼠在高濃度氧環(huán)境下共飼養(yǎng)5 d,嚴(yán)密關(guān)注是否有死亡的小鼠。待鼠齡12 d 將上述兩組小鼠移至空氣中,與空白對照組一同飼養(yǎng)直至鼠齡17 d,觀察三組小鼠的一般情況、活動能力、體重。其中Ang-1+BMSCs 高氧組在鼠齡第6 天、第10 天、第14 天分別于顯微鏡下向玻璃體內(nèi)注射轉(zhuǎn)染Ang-1 基因的BMSCs 細(xì)胞(0.1 ml/只),內(nèi)含細(xì)胞數(shù)平均為 1×106/0.1 ml,空白對照組和高氧鹽水組在鼠齡第6 天、第10 天、第14 天分別注射同等劑量的9%氯化鈉溶液。

從液氮儲罐中取出BMSCs 菌株,將其置于37.0℃的溫水中。緩慢搖晃裝有BMSC 的橡膠手套,直到BMSC 逐漸融化為液體。然后將裝有BMSC 的冷凍管放在測試臺上,通風(fēng),將BMSCs 懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管中,加入細(xì)胞培養(yǎng)基,緩慢吸移使其完全混合,1000 r/min,離心5 min；用移液管棄去上清液,加入含血清的培養(yǎng)基,用移液管吸移,在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞復(fù)蘇后,將復(fù)蘇的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中,觀察1 d 后細(xì)胞融合程度,更換細(xì)胞培養(yǎng)基,在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞貼壁超過80%時,進(jìn)行亞培養(yǎng)；去除舊培養(yǎng)基,添加PBS 緩沖液沖洗培養(yǎng)瓶,棄去PBS 緩沖液,沖洗3 次,用胰蛋白酶消化,搖動培養(yǎng)瓶,讓胰酶充分接觸細(xì)胞,將其置于37.0℃的培養(yǎng)箱中,并進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)其處于絮凝狀態(tài),細(xì)胞會縮回,則培養(yǎng)完成。該過程在超凈工作臺上進(jìn)行；在顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞的縮回狀態(tài)。細(xì)胞和細(xì)胞之間的空間變大,并且細(xì)胞呈球狀,當(dāng)少量細(xì)胞脫離壁時,應(yīng)立即終止消化。用移液器輕輕吹動瓶壁,使細(xì)胞與瓶壁分離,形成單細(xì)胞懸液。在顯微鏡下觀察瓶壁,細(xì)胞幾乎完全脫落后,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,1000 r/min,離心5 min,除去上清液,加入適量的培養(yǎng)基,用玻璃移液管吹動細(xì)胞,在顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞數(shù)量。以1∶2 的速率亞培養(yǎng)細(xì)胞數(shù),觀察培養(yǎng)基的顏色,并根據(jù)細(xì)胞的粘附性每天更換一次培養(yǎng)基；每天在顯微鏡下觀察并記錄亞培養(yǎng)的情況。

觀察每組小鼠的發(fā)育情況,在18 d 時從每組小鼠中獲取視神經(jīng)組織,行蘇木精-伊紅染色法(HE)和固藍(lán)染色(FASTBLUE,LFB)、免疫熒光檢測、免疫組化染色及透射電子顯微鏡觀察。

1.3 觀察指標(biāo) 比較三組小鼠有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、直徑、軸索直徑及髓鞘厚度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,三組比較采用方差檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

空白對照組、Ang-1+BMSCs 高氧組軸索直徑顯著長于高氧鹽水組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三組軸索直徑比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M、Ang-1+BMSCs 高氧組有髓神經(jīng)纖維直徑長于高氧鹽水組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三組有髓神經(jīng)纖維直徑比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高氧鹽水組、Ang-1+BMSCs 高氧組有髓神經(jīng)纖維數(shù)目低于空白對照組,Ang-1+BMSCs 高氧組神經(jīng)纖維數(shù)量明顯高于高氧鹽水組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M、Ang-1+BMSCs 高氧組髓鞘厚度大于高氧鹽水組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三組髓鞘厚度比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組小鼠有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、直徑、軸索直徑及髓鞘厚度比較()

表1 三組小鼠有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、直徑、軸索直徑及髓鞘厚度比較()

注：三組比較,P<0.05

3 討論

用透射電鏡觀察各組的視神經(jīng),高氧鹽水組視神經(jīng)纖維的髓鞘清晰可見,軸索與髓鞘之間有縫隙,可見髓鞘板層狀分離,軸索水腫,線粒體腫脹,軸索中的微絲溶解,微管丟失,并形成液泡。有髓神經(jīng)纖維的直徑和數(shù)量減小,而無髓神經(jīng)纖維的數(shù)量增多。空白對照組,高氧鹽水組和Ang-1+BMSCs 高氧組分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)定量分析,空白對照組和Ang-1+BMSCs 高氧組的有髓神經(jīng)纖維直徑和軸索直徑長于高氧鹽水組,Ang-1+BMSCs 高氧組、空白對照組有髓神經(jīng)纖維數(shù)目和髓鞘厚度明顯大于高氧鹽水組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),這表明Ang-1 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 可幫助恢復(fù)高氧誘導(dǎo)所致視神經(jīng)損傷的超微結(jié)構(gòu)。本研究將Ang-1基因轉(zhuǎn)染至 BMSCs 中,觀察Ang-1 基因和BMSCs 對高氧誘導(dǎo)所致視神經(jīng)損傷的協(xié)同保護(hù)作用,研究結(jié)果表明,Ang-1 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 可能對高氧誘導(dǎo)新生小鼠的視神經(jīng)損傷有一定的保護(hù)作用,表明干細(xì)胞治療是一種具有發(fā)展前景的視神經(jīng)損傷治療方式。

高氧誘導(dǎo)的新生小鼠視神經(jīng)損傷會自發(fā)性退縮,因此不可能進(jìn)行長期研究,并且,Ang-1 能否保持長效,各研究者存在意見分歧,此外,Ang-1 的用藥方法、用藥劑量以及使用后是否會對角膜、晶狀體等產(chǎn)生毒副反應(yīng)仍不確定,需進(jìn)行深入的研究以證實［6］。本研究選取的BMSCs 免疫應(yīng)答性能較弱,其分化能力相比胚胎干細(xì)胞較弱,同時我國對于干細(xì)胞研究缺少相應(yīng)的法律制度,導(dǎo)致當(dāng)前關(guān)于干細(xì)胞的研究監(jiān)管力度不大,科學(xué)性和合理性較低,僅停留于動物階段。當(dāng)前我國出現(xiàn)的研究大多是關(guān)于BMSCs 對視神經(jīng)的保護(hù)作用,很多研究仍在持續(xù)進(jìn)行,并且部分實驗已經(jīng)完成,大部分研究是關(guān)于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)和軸突生長方面的研究［7］。另外,以后的研究可能需對視覺功能進(jìn)行分析以探討干細(xì)胞的作用機(jī)制,對于制定安全性和有效性均較高的治療方法意義重大。不可否認(rèn)的是,這是一個艱巨而持久的任務(wù),并且需在顯微領(lǐng)域以及免疫領(lǐng)域都獲得進(jìn)步。

綜上所述,高氧誘導(dǎo)新生鼠視神經(jīng)損傷后將Ang-1 基因轉(zhuǎn)染到BMSCs 中可以明顯改善受損視神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)。但是,視神經(jīng)損傷的長期作用及其機(jī)制尚需深入研究。