徐小溪，陳云華，陶 雪，唐 竹，龔亞?wèn)|，林 牧

(貴州航天醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

肺結(jié)核(TB)與糖尿病(DM)均是常見(jiàn)的慢性疾病，兩者并發(fā)時(shí)可相互影響，加重病情[1]。TB使DM患者的糖代謝紊亂加重，血糖水平不易控制；DM的糖代謝紊亂又易引發(fā)蛋白質(zhì)和脂肪的代謝障礙，增加血液和組織內(nèi)含糖量、降低血清蛋白、增高血脂水平等，進(jìn)而降低免疫功能，使TB患者病情惡化[2-3]。加之日益遞增的耐藥結(jié)核患者，增大了疾病防控和治療的難度[4]。

WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年全球48.4萬(wàn)例利福平(RIF)耐藥結(jié)核病患者中，中國(guó)占14%，位居全世界第二[5]。而貴州省為我國(guó)結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率居全國(guó)第四，耐藥率居全國(guó)第一；主要集中在遵義、畢節(jié)、銅仁和黔東南等地區(qū)[6]。RIF作為抗結(jié)核治療方案中關(guān)鍵的一線藥物，在結(jié)核病的治療中一直具有重要作用，這與RIF的作用靶點(diǎn)RNA聚合酶 β 亞單位所編碼的 rpoB 基因突變有關(guān)[7-8]。本研究選取遵義市區(qū)的TB患者，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(MTB)-DNA和MTB-RNA，以及rpoB 中包含RIF耐藥性決定區(qū)的部分基因[9]，探究遵義地區(qū)TB患者和DM合并TB患者結(jié)核分枝桿菌 rpoB 基因的突變與RIF耐藥之間的相關(guān)性，以明確遵義地區(qū)MTB RIF耐藥的分子生物學(xué)特征。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 本研究收集2017年12月至2019年7月于本院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科就診的763例TB患者的痰液或沖洗液標(biāo)本，采用MTB-DNA、MTB-RNA和抗酸染色檢測(cè)。排除31例重復(fù)檢測(cè)者，余結(jié)果均為陽(yáng)性者行RIF耐藥基因檢測(cè)，比較TB患者(525例)與TB合并DM患者(207例)發(fā)生RIF耐藥的相關(guān)性，同時(shí)搜集納入患者相關(guān)臨床資料。TB及DM分別依據(jù)《WS 288-2017肺結(jié)核診斷》及美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)制定的《糖尿病診治指南》標(biāo)準(zhǔn)確診，見(jiàn)表1。

表1 TB及DM診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.2主要儀器和試劑 宏石SLAN-96P熒光定量PCR儀、ABI-2710核酸擴(kuò)增儀、天隆TL988熒光定量PCR儀等；MTB-DNA檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?由成都博奧晶芯生物科技有限公司提供；MTB-RNA檢測(cè)試劑盒(RNA恒溫?cái)U(kuò)增)由上海仁度生物科技有限公司提供；MTB RIF耐藥基因檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1MTB-DNA和MTB-RNA檢測(cè)

1.2.1.1MTB-DNA和MTB-RNA提取 在患者痰液或支氣管灌洗液標(biāo)本中加入等體積的氫氧化鈉(濃度為4%)，震蕩混勻后靜置15 min以充分液化；12 000 r/min離心10 min后棄上清液，加入1 mL清洗液(主要成分為生理鹽水)混勻后12 000 r/min離心5 min后棄上清液。將沉淀分為兩管，分別加入50 μL核酸提取液(用以提取DNA)和50 μL稀釋液(用以提取RNA)，超聲裂解10 min后，DNA提取管置于震蕩金屬浴中，100 ℃伴1 800 r/min震蕩10 min后12 000 r/min離心5 min，RNA提取管直接12 000 r/min離心5 min，棄上清液。

1.2.1.2MTB-DNA和MTB-RNA檢測(cè)方法 MTB-DNA PCR反應(yīng)體系共20 μL，由探針、Taq酶、引物等共18 μL和模板2 μL構(gòu)成；擴(kuò)增程序?yàn)?7 ℃ 300 s和94 ℃ 180 s一次循環(huán)；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s 經(jīng)40個(gè)循環(huán)；50 ℃ 10 s單次循環(huán)。MTB-RNA PCR反應(yīng)體系共32 μL，由探針、反轉(zhuǎn)錄酶、引物等共30 μL和模板2 μL構(gòu)成；擴(kuò)增程序?yàn)?2 ℃ 60 s 40個(gè)循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增。結(jié)果判讀均為陽(yáng)性者，留取DNA擴(kuò)增產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2抗酸染色 實(shí)驗(yàn)由本院檢驗(yàn)科完成。統(tǒng)計(jì)MTB-DNA和MTB-RNA陽(yáng)性者名單，比對(duì)抗酸染色結(jié)果亦為陽(yáng)性者，搜集以上患者相關(guān)臨床信息。

1.2.3血糖測(cè)定 檢測(cè)納入患者任意時(shí)間血糖和FPG，依據(jù)表1的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分為單純TB組和TB合并DM組。

1.2.4PCR-反向點(diǎn)雜交

1.2.4.1PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系共25 μL，由dNTP、Taq酶、引物等共21 μL和模板DNA 4 μL構(gòu)成；擴(kuò)增程序?yàn)?0 ℃ 120 s和94 ℃ 600 s一次循環(huán)；95 ℃ 45 s，68 ℃ 60 s 經(jīng)30個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s經(jīng)30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 600 s單次循環(huán)。RIF耐藥性檢測(cè)基因突變位點(diǎn)見(jiàn)表2。

表2 rpoB基因突變位點(diǎn)

1.2.4.2雜交和顯色 將膜條編號(hào)并放入含PCR擴(kuò)增產(chǎn)物緩沖液的15 mL離心管中。100 ℃ 10 min、59 ℃ 90 min后將膜條放入含枸櫞酸鈉緩沖液的50 mL離心管中，59 ℃ 輕搖洗滌15 min。將膜條放入含辣根過(guò)氧化物酶的顯色液中10 min，觀察相應(yīng)顯色點(diǎn)后判讀rpoB基因突變情況。

2 結(jié) 果

2.1相關(guān)因素分析 TB組發(fā)生RIF耐藥患者52例，其中22例伴低蛋白敗血癥，30例血尿酸水平升高；TB合并DM組發(fā)生耐藥患者29例，其中16例伴低蛋白敗血癥，15例血尿酸水平升高。對(duì)比耐藥TB、TB合并DM患者的性別、年齡、職業(yè)等因素和血清清蛋白等檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)40～<65歲患者較其他年齡段更易發(fā)生TB合并DM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各組其余因素組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 RIF耐藥患者的一般情況[n(%)]

2.2PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果 rpoB基因檢測(cè) 732例TB患者，其中RIF耐藥TB患者52例，RIF耐藥TB合并DM患者29例。

2.3耐藥基因rpoB突變位點(diǎn)分布 兩組患者發(fā)生突變的位點(diǎn)無(wú)明顯差異，TB合并DM組患者中有13例發(fā)生ropB531位點(diǎn)突變(突變率為44.83%)，有15例發(fā)生ropBS531L位點(diǎn)突變(突變率為51.72%)；TB組中有30例發(fā)生ropB531位點(diǎn)突變(突變率為57.69%)，有31例發(fā)生ropBS531L位點(diǎn)突變(突變率為59.62%)。TB合并DM組患者ropBS531L、ropB531位點(diǎn)突變率均低于TB組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。且兩組均存在ropB531和ropBS531L兩位點(diǎn)相伴突變。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組患者耐藥基因rpoB位點(diǎn)突變情況

3 討 論

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，TB合并DM的發(fā)生率逐年提高，不僅增強(qiáng)機(jī)體分解代謝、引起食欲下降、影響胰腺的分泌功能，而且糖代謝異常易引起蛋白質(zhì)和脂肪的代謝失調(diào)，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良和細(xì)胞免疫功能下降，進(jìn)而加重病情[10-11]。若再發(fā)生RIF耐藥，將嚴(yán)重影響患者的治療，不僅增加了治療的難度和費(fèi)用，而且病情難以控制，導(dǎo)致治愈率降低和病死率升高[12]。故早期確診耐藥結(jié)核是提高療效的關(guān)鍵。相較培養(yǎng)法，采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)RIF的耐藥位點(diǎn)突變，能很好地解決時(shí)效性問(wèn)題，且RIF耐藥分子機(jī)制比較明確，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

本研究通過(guò)763例TB患者痰液或沖洗液標(biāo)本的MTB-DNA、MTB-RNA和抗酸染色檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性者行RIF耐藥基因檢測(cè)，TB患者525例，其中RIF耐藥52例，TB合并DM患者207例，其中RIF耐藥29例。基因突變位點(diǎn)均以ropBS531L和ropB531多見(jiàn)，且兩位點(diǎn)幾乎相伴突變，與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道相符[13]。本研究中TB組ropB531位點(diǎn)突變率(57.69%)高于福建省(53.3%)、四川省(55.87%)，低于廣東省(63.22%)及廣西壯族自治區(qū)(59.26%),印證了rpoB基因突變的發(fā)生頻率有明顯的地域差異[14-15]，不同國(guó)家和地區(qū)的基因突變頻率呈現(xiàn)出不同差異[16]，可能與當(dāng)?shù)豈TB的進(jìn)化有關(guān)，同時(shí)證明了RIF耐藥機(jī)制的發(fā)生與ropB基因突變有關(guān)。本研究首次統(tǒng)計(jì)了遵義地區(qū)TB合并DM患者發(fā)生RIF耐藥的突變位點(diǎn)，主要以ropBS531L(51.72%)和ropB531(44.83%)為主，且相應(yīng)位點(diǎn)的突變率低于單純TB患者[ropBS531L(59.62%)和ropB531(57.69%)]，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與樣本量較少有關(guān)。

本研究還搜集了納入患者相關(guān)臨床資料，以分析其與耐多藥MTB感染間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)40～<65歲年齡區(qū)間更易發(fā)生TB合并DM，這可能與DM高發(fā)人群的年齡常分布于此區(qū)間有關(guān)[17]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與單純TB患者相比，TB合并DM患者的血清清蛋白水平略有下降，這可能與TB合并DM患者不能充分利用葡萄糖，需分解蛋白質(zhì)和脂肪提供熱量，使機(jī)體清蛋白合成減少有關(guān)[18]。但因本研究樣本量有限，相關(guān)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仍需擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步研究。