郭翔宇，賈凱琪，韓 琦，馬曉燕，黨文慶，王 鍇，李雅婷，李鵬飛，呂麗華*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

哺乳動物卵巢卵泡從早期腔前卵泡到成熟卵泡的發(fā)育受不同內(nèi)源性因素的調(diào)節(jié)，其中，BMP/Smad 信號通路在其發(fā)育的不同階段發(fā)揮了不可替代的作用[1-8]。Smads 蛋白（Smad1-9）在TGF-β家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中起重要作用[9-11]，細(xì)胞外的BMPs 配體激活細(xì)胞上的I 型和II 型受體，并激活Smads 蛋白將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞核中，并且每一個Smads 蛋白在信號傳遞過程中起不同的作用[12-13]。按功能作用不同，Smads 分為受體激活型R-Smads（Smad1/2/3/5/8/9）、共調(diào)節(jié)型Co-Smad（Smad4）和抑制型I-Smads（Smad6/7）三大類，其中，Smad1/5/8/9 調(diào)節(jié)BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。Tsukamoto 等[15]研究表明，雖 然Smad9 與Smad1 和Smad5 具有高度相似的結(jié)構(gòu)，但Smad9 降低BMP 活性，抑制了Smads 的轉(zhuǎn)錄活性。Katakawa 等[16]研究也表明，Smad8/9在mRNA 水平上通過BMP 途徑調(diào)控，是一個獨特的R-Smad；Xu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Smad9 蛋白參與鵝卵泡發(fā)育的啟動，并通過外顯子1 和內(nèi)含子2 的同義突變改變鵝的產(chǎn)卵量；Yu 等[18]通過體內(nèi)和體外試驗表明，Smad9 參與鵝卵泡的發(fā)育。因此，Smad9 在BMP/Smad 信號通路的調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要的作用。張小輝[19]通過生物信息學(xué)分析表明，牛Smad9基因在不同的組織中廣泛表達(dá)，但尚未在牛卵巢卵泡中具體研究其表達(dá)和定位。本研究通過免疫組化對Smad9 進(jìn)行免疫定位，并檢測Smad9基因和Smad9 蛋白在牛小、中、大卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，為Smad9基因和Smad9 蛋白在牛卵巢卵泡中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 從山西省呂梁市文水縣屠宰場采集健康且發(fā)情周期處于第II、IV 階段的成年母牛卵巢[20]。

1.2 實驗試劑 RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（日本，TaKaRa）；增強(qiáng)型RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑（PMSF）、封閉蛋白干粉、4%多聚甲醛、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、硝酸纖維素薄膜（NC 膜）、蘇木素（武漢，博士德生物工程有限公司）；SP Rabbit HRP Kit（DAB）、蛋白上樣緩沖液（5X）（北京，康為世紀(jì)生物科技有限公司）；M5 Prestained Protein Ladder with 45 ku（10～180 ku）（北京，聚合美生物科技有限公司）；Rabbit Anti-SMAD9 antibody (bs-4253R)（北京，博奧森生物技術(shù)有限公司）；β-actin polyclonal antibody（美國，BioWorld）、IRDye800CW Goat anti-Rabbit（美國，LI-COR）；無水乙醇、二甲苯、異丙醇、氯仿等分析純試劑為國產(chǎn)試劑；引物均來自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離牛小、中、大卵泡并收集顆粒細(xì)胞 成年母牛屠殺后，用滅菌4℃杜氏磷酸緩沖液（DPBS）清洗卵巢2 次，去除血液，分離卵泡，并按照相關(guān)文獻(xiàn)[21-24]將收集到的卵泡分為小（2 mm ≤直徑≤4 mm）、中（4 mm<直徑<8 mm）、大（直徑≥8 mm）3 類，再次用DPBS沖洗卵泡，去除卵泡表面的組織塊，分別放入裝有PBS的3 個表面皿中，用注射器扎破卵泡，將卵泡剪開，用刮刀刮取卵泡內(nèi)壁顆粒細(xì)胞，收集含有顆粒細(xì)胞的PBS于15 mL 管內(nèi)，800×g 離心5 min，留沉淀，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 牛卵巢卵泡免疫組織化學(xué) 將分離得到的不同直徑的卵泡浸于盛有4%多聚甲醛的50 mL 離心管中，4℃過夜。脫水包埋于石蠟中，制成6 μm 的石蠟切片，在3% H2O2中浸泡10 min，再使用檸檬酸鈉緩沖溶液進(jìn)行抗原熱修復(fù)。Smad9 抗體以1:100 的比例進(jìn)行稀釋，一抗孵育過夜，在37℃溫箱中復(fù)溫30 min，PBS 洗滌2 次，3 min/次，二抗孵育10 min，PBS 洗滌2 次，3 min/次，配置DAB 顯色液，進(jìn)行DAB 染色，達(dá)到最佳染色效果后，自來水沖洗，終止顯色。用蘇木精對切片復(fù)染后，將切片脫水，中性樹脂封片，用生物顯微鏡觀察并進(jìn)行拍照。

1.3.3 RT-qPCR 按照RNAiso Plus 說明書要求，向樣品中添加RNAiso Plus，依據(jù)Trizol 法獲得每組顆粒細(xì)胞的RNA。用核酸測定儀測定每組RNA 濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列見表1，根據(jù)GenBank 中收錄的牛（Bos taurus）Smad9基因（NM_001076928.1）mRNA 序列設(shè)計引物，選用RPLP0作為qPCR 試驗的內(nèi)參基因。按照熒光定量試劑盒說明，反應(yīng)體系10 μL：Sense Primer 0.4 μL（0.4 μmol/L），Anti-sense Primer 0.4 μL（0.4 μmol/L），TB Green Premix Ex Taq II（2X）5 μL，去RNA 酶H2O 3.2 μL，cDNA 模 板1 μL（100 ng）。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)45 次；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 5 s。每個樣做3 個檢測重復(fù)。

1.3.4 Western Blotting 將增強(qiáng)型RIPA 裂解液（含1%PMSF）向收集小、中、大卵泡顆粒細(xì)胞的1.5 mL離心管中各加200 μL，30 min 后4℃離心，通過BCA法測定蛋白濃度。以4:1 的比例將蛋白與蛋白上樣緩沖液（5'）混勻，100℃變性10 min。通過非還原的10%SDS/PAGE 凝膠分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移到NC 膜上，其中，電泳條件：80 V 30 min；120 V 80 min；轉(zhuǎn)膜條件：100 V 90 min。然后將NC 膜用5% 脫脂奶粉溶液孵育1 h。之后用TBST 洗3 次，5 min/次，然后將Rabbit Anti-SMAD9 antibody 與TBST 以1:500 稀釋，4℃孵育過夜（12～16 h），用TBST 洗3 次，8 min/次，避光孵育二抗（1:18 000）1 h。用TBST 洗3 次，8 min/次，再將NC 膜浸于TBS 中5 min。將NC 膜置于Odyssey CLx 中依次曝光。

1.4 統(tǒng)計分析 qPCR 數(shù)據(jù)運(yùn)用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，內(nèi)參基因為RPLP0基因。Western blotting 數(shù)據(jù)用Image J和Image Studio Ver 進(jìn)行分析，內(nèi)參蛋白為β-actin。數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，且均經(jīng)SPSS 22.0（IBM SPSS Statistics 22.0）進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 Smad9 在牛小、中、大卵泡中的定位分析 使用Smad9 抗體對牛卵巢切片進(jìn)行免疫染色（400'），結(jié)果如圖1 所示，對照組無特異性免疫染色，實驗組Smad9在顆粒細(xì)胞層和膜細(xì)胞層中有免疫反應(yīng)。實驗組Smad9在小卵泡和中卵泡顆粒細(xì)胞層中有明顯的免疫反應(yīng)，呈顏色較深的棕褐色，而在大卵泡顆粒細(xì)胞層中免疫反應(yīng)弱，呈顏色較淺的棕黃色；與顆粒細(xì)胞層相比，Smad9在小卵泡和大卵泡膜細(xì)胞層中免疫反應(yīng)較弱，呈顏色較淺的棕黃色，而中卵泡與小卵泡、大卵泡相比免疫反應(yīng)較強(qiáng)，呈棕褐色。

圖1 牛卵泡Smad9 的表達(dá)（400×）

2.2Smad9在牛小、中、大卵泡顆粒細(xì)胞中的mRNA表達(dá) 如圖2 所示，小卵泡和中卵泡GC 中Smad9mRNA 轉(zhuǎn)錄本相對豐度低于大卵泡GC（P<0.01），而中卵泡的GC 內(nèi)Smad9mRNA 轉(zhuǎn)錄本相對豐度低于小卵泡（P<0.05）。

2.3 Smad9 在牛小、中、大卵泡顆粒細(xì)胞中的蛋白表達(dá)如圖3 所示，以β-actin 為內(nèi)參，小、中、大卵泡的顆粒細(xì)胞中Smad9 蛋白表達(dá)量有差異。大卵泡顆粒細(xì)胞中Smad9 蛋白含量約為小卵泡的1.4 倍（P<0.01），約為中卵泡的1.5 倍（P<0.01），而中卵泡GC 中Smad9蛋白含量是小卵泡的0.9 倍（P<0.05）。

圖2 小、中、大卵泡中Smad9mRNA 相對豐度（n=3）

圖3 小、中、大卵泡中Smad9 蛋白相對表達(dá)量（n=3）

3 討 論

牛屬于單胎哺乳動物，卵泡發(fā)育過程包括卵泡的募集、選擇、優(yōu)勢化以及閉鎖和成熟卵泡的排卵過程[25]。卵泡募集過程中，每個卵泡發(fā)育波有4～10 個直徑約為4 mm 的卵泡進(jìn)行募集[26]。募集完成后，只有1～2 個卵泡被選擇變?yōu)閮?yōu)勢卵泡，其他卵泡變?yōu)閺膶俾雅輀27]，此時優(yōu)勢卵泡約為8 mm，其他卵泡受激素影響將閉鎖退化。牛卵泡在進(jìn)行募集過程中卵泡的大小為2～4 mm，卵泡選擇過程中卵泡的大小為4～8 mm，卵泡的優(yōu)勢化后卵泡的直徑大于8 mm，即小卵泡（2 mm ≤直徑≤4 mm）、中卵泡（4 mm<直徑<8 mm）、大卵泡（直徑≥8 mm）[24]，牛卵泡的發(fā)育過程受多種內(nèi)源性因素調(diào)控，其中BMP/Smad 信號通路起關(guān)鍵作用。

在BMP/Smad 信號通路中，Smad9 是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在不同組織中廣泛分布，同時調(diào)節(jié)多種類型細(xì)胞的生長發(fā)育[16,19]，Tsukamoto 等[15]研究表明Smad9 是一種新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Smad8/9 在BMP/Smad 信號通路中有顯性負(fù)調(diào)節(jié)作用。Yu 等[18]通過分離鵝的不同大小卵泡進(jìn)行免疫組化試驗，首次揭示了Smad9 在不同發(fā)育階段卵泡的顆粒細(xì)胞層中特異性表達(dá)。同時，余道倫[28]研究表明，Smad9 僅在小鼠卵泡的顆粒細(xì)胞層中表達(dá)。本研究通過免疫組化試驗顯示，Smad9 在牛小、中、大卵泡的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞層中有表達(dá)。Smad9 在不同物種的定位不同表明其具有物種特異性。Yu 等[18]研究表明，在鵝不同大小的卵泡中Smad9 的蛋白質(zhì)和mRNA 表達(dá)有差異，揭示了Smad9蛋白和mRNA 表達(dá)的時空模式。本研究結(jié)果顯示，在基因和蛋白水平上Smad9 表達(dá)存在差異，大卵泡的顆粒細(xì)胞中Smad9 的相對表達(dá)量與小卵泡、中卵泡差異極顯著，而小卵泡的顆粒細(xì)胞中Smad9 的相對表達(dá)量與中卵泡存在顯著差異，提示Smad9 可能調(diào)節(jié)卵泡的募集、選擇與優(yōu)勢化過程。Xu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Smad9具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，Smad9與鵝卵泡的生長發(fā)育密切相關(guān)，并且Smad9mRNA 和Smad9 蛋白質(zhì)的表達(dá)影響雌二醇的分泌、LHR的表達(dá)以及顆粒細(xì)胞的增殖。余道倫等[28]在使用RNA 干擾技術(shù)干擾Smad8 后，發(fā)現(xiàn)小鼠卵泡的顆粒細(xì)胞分泌雌二醇的能力減弱，并且LHRmRNA 表達(dá)水平下降，顆粒細(xì)胞的增殖明顯減弱。王和建等[29]通過小鼠腹腔注射BMP4，誘導(dǎo)Smad9 的表達(dá)增加，促進(jìn)有腔卵泡的數(shù)目增多。Zhang 等[30]研究表明，Smad9 與雌二醇的分泌和LHR 的轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)，并影響顆粒細(xì)胞增殖。由此得出，Smad9 影響顆粒細(xì)胞的增殖和類固醇激素的分泌，從而影響卵泡的發(fā)育。本研究中Smad9 在牛小、中、大卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)存在差異，推測Smad9 可能調(diào)節(jié)牛卵泡的募集、選擇和優(yōu)勢化過程。因此，下一步將進(jìn)行Smad9 的功能研究，為改善母牛繁殖能力提供新思路。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果顯示，牛卵泡的顆粒細(xì)胞層中有Smad9表達(dá)，不同直徑卵泡的顆粒細(xì)胞中Smad9 的表達(dá)量不同，Smad9 大卵泡中的表達(dá)量極顯著高于小卵泡和中卵泡。因此，Smad9 可能參與有腔卵泡的發(fā)育過程。