任 菲，于治國*，陸 峰

(1.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016;2.第二軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200082)

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉菌的某些菌株產(chǎn)生的一類致突變、致癌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)是其中具有代表性的一員，其毒性僅次于黃曲霉毒素B1(AFB1)，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素G1列為2B類毒素[2]。據(jù)報(bào)道，我國華北地區(qū)具有高發(fā)病率的肺癌和食管癌與黃曲霉毒素G1存在很大聯(lián)系[3]。進(jìn)一步研究表明，黃曲霉毒素G1通過誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞DNA氧化損傷導(dǎo)致小鼠肺癌的發(fā)生[4]。薏苡仁中藥材在生長、采集、儲(chǔ)藏以及加工過程中易造成霉菌及霉菌毒素的污染，產(chǎn)生較多的黃曲霉毒素等霉菌毒素[5]。如諸晨等[6]在對比不同產(chǎn)地薏苡仁的黃曲霉毒素含量中發(fā)現(xiàn)安徽一批薏苡仁中黃曲霉毒素G1含量高達(dá)149 μg/kg，是黃曲霉毒素B1的4倍。同時(shí)薏苡仁為藥食兩用常用中藥材，使用范圍廣、用量大。因而對薏苡仁中黃曲霉毒素G1的監(jiān)控具有重要意義。

目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[7-8]、高效液相色譜法(HPLC)[9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法(LC-MS)[10]、薄層色譜法(TLC)[11]等。這些方法雖有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但樣品提取和分離過程復(fù)雜，且凈化小柱的價(jià)格高昂，檢測時(shí)間長，儀器耗損大。因此，亟待建立一種適用于中藥材中黃曲霉毒素的快速且簡便的現(xiàn)場檢測方法。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)是指光照射到納米級(jí)別的粗糙貴金屬(如金、銀等)的表面，引起拉曼信號(hào)顯著增強(qiáng)的異常光學(xué)增強(qiáng)現(xiàn)象[12]。SERS技術(shù)具有靈敏度高，熒光背景低，檢測速度快，提供化學(xué)指紋信息，儀器尺寸小適合現(xiàn)場分析等優(yōu)勢，從而廣泛應(yīng)用于藥品、食品、環(huán)境等領(lǐng)域。動(dòng)態(tài)表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(D-SERS)是在納米溶膠從濕態(tài)轉(zhuǎn)變到干態(tài)過程中實(shí)時(shí)進(jìn)行的光譜采集，比SERS信號(hào)增加了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。本文利用簡單的擦拭法提取薏苡仁表面的黃曲霉毒素G1，以納米金為活性基底，采用D-SERS法檢測中藥材中黃曲霉毒素G1，該方法快速、簡便，在大批量樣品的現(xiàn)場分析中具有良好的應(yīng)用潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、檸檬酸鈉(C6H5Na3O7)及碘化鉀(KI)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。黃曲霉毒素G1(bepure?)。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。薏苡仁中藥材購買于藥店。

BWS415-785H便攜式拉曼光譜儀(必達(dá)泰克光電科技(上海)有限公司)，激發(fā)波長為785 nm，光譜分辨率為3 cm-1，光譜測量范圍為0～3 000 cm-1。Smart-D UV掃描電子顯微鏡(德國Carl-Zeiss公司)。

1.2 金溶膠的制備

金溶膠參考經(jīng)典檸檬酸鈉還原氯金酸法制備并稍作改動(dòng)[13]：向100 mL去離子水中加入4.8 mL 1% HAuCl4水溶液，邊攪拌邊加熱，待其沸騰時(shí)迅速加入4.3 mL 1%檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌，10 min后停止反應(yīng)，自然冷卻至室溫，將所得酒紅色溶液倒入棕色瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫频?0 nm金溶膠。

1.3 樣品前處理及D-SERS檢測

取約2.0 g中藥材薏苡仁，噴灑不同量黃曲霉毒素G1溶液并烘干，得薏苡仁中黃曲霉毒素G1的含量分別為8、20、40、80、160、320 μg/kg。乙腈作為潤濕劑潤濕薏苡仁表面，再用濾紙擦拭表面，將擦拭后的濾紙浸入乙腈中，并充分渦旋，讓附著在濾紙表面的黃曲霉毒素G1溶于乙腈。然后去除濾紙，將剩余乙腈溶液揮干，加入乙腈復(fù)溶。得到從薏苡仁表面提取的黃曲霉毒素G1濃縮液。

將金溶膠濃縮20倍后，加入10 μL 1 mmol/L KI溶液，并孵育30 min，與黃曲霉毒素G1提取濃縮液等量混合，滴在硅片上，將便攜式拉曼光譜儀的激光持續(xù)聚焦在液滴表面，激發(fā)波長為785 nm，激光功率為20%，積分時(shí)間為5 s，進(jìn)行D-SERS信號(hào)采集。

2 結(jié)果與討論

2.1 金溶膠的表征

金屬納米粒子的尺寸、表面粗糙度等因素會(huì)影響其光學(xué)性質(zhì)，因此對所制備的水相金溶膠進(jìn)行掃描電鏡(SEM)和紫外光譜(UV-Vis)表征。結(jié)果顯示，制備的金納米顆粒呈球形且分布均勻，粒徑約為50 nm(圖1A)，紫外最大吸收波長在536 nm處(圖1B)。

圖1 納米金的掃描電子顯微鏡圖(A)及紫外吸收光譜(B)Fig.1 SEM image(A) and ultraviolet absorption spectra(B) of gold nanopartieles

2.2 黃曲霉毒素G1的D-SERS光譜與特征峰歸屬

將配好的金溶膠與2 μg/mL黃曲霉毒素G1溶液等體積混合，取2 μL混合液滴于硅片上，激光聚焦在液滴中間，采集光譜直到液滴完全變干，整個(gè)過程得到的D-SERS光譜如圖2所示。由圖可見，黃曲霉毒素G1信號(hào)呈遞增趨勢，達(dá)到最大值后維持一段時(shí)間，然后信號(hào)逐漸減弱甚至消失。此規(guī)律由楊良保等[14]最先發(fā)現(xiàn)：隨著溶劑的不斷揮發(fā)，納米顆粒間距離不斷縮小，因此在第一階段濕態(tài)下，待測物的信號(hào)不斷增強(qiáng)。當(dāng)納米顆粒間距達(dá)1～10 nm時(shí)，進(jìn)入了第二階段，即臨界狀態(tài)，此時(shí)所形成的熱點(diǎn)有較高的均勻度和較強(qiáng)的捕獲能力，使得檢測具有較高的靈敏度和重現(xiàn)性。隨后納米粒子間的距離進(jìn)一步縮短，熱點(diǎn)也逐漸減少，拉曼信號(hào)迅速減弱，直到液滴完全變干，熱點(diǎn)消失。因此，臨界狀態(tài)具有一定的一致性和穩(wěn)定性，選擇該狀態(tài)的光譜進(jìn)行SERS檢測和分析十分可靠。

圖2 黃曲霉毒素G1的D-SERS光譜Fig.2 D-SERS spectrum of aflatoxin G1

表1 黃曲霉毒素G1的SERS光譜及固體標(biāo)準(zhǔn)品的常規(guī)拉曼光譜(NRS)的譜峰歸屬Table 1 SERS vibration modes attribution of aflatoxin G1 and normal raman spectrum(NRS) of solid standard

2.3 薏苡仁中黃曲霉毒素G1檢測方法的建立

由于中藥基質(zhì)復(fù)雜，若直接從中藥粉末中提取總的黃曲霉毒素G1再進(jìn)行D-SERS檢測，會(huì)得到很多中藥成分的干擾峰，甚至?xí)采w黃曲霉毒素G1的特征峰。因此，實(shí)驗(yàn)選擇擦拭法提取中藥表面的黃曲霉毒素G1。這一方面是因?yàn)椴潦梅ㄊ怯脼V紙擦試經(jīng)過潤濕的中藥表面，僅提取附著在表面的黃曲霉毒素G1，相比其他方法需復(fù)雜的提取步驟以及固相萃取除去大部分中藥成分具有操作簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)；另一方面，擦拭法僅帶走藥材表面的成分，使得基質(zhì)的復(fù)雜性以及含量均大幅減少，從而降低了對黃曲霉毒素G1檢測的干擾。

取6份薏苡仁，分別噴灑不同量黃曲霉毒素G1，得到薏苡仁中黃曲霉毒素G1的含量分別為8、20、40、80、160、320 μg/kg。在優(yōu)化條件下，采用乙腈作為潤濕劑潤濕藥材表面，取0.5×0.5 cm2大小的濾紙擦拭藥材表面，再將濾紙浸入乙腈，然后將乙腈溶液揮干并復(fù)溶，得到含有系列濃度的黃曲霉毒素G1的薏苡仁提取濃縮液，并進(jìn)行D-SERS檢測，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過與空白對照對比發(fā)現(xiàn)，在薏苡仁成分的干擾下，黃曲霉毒素G1的大部分特征峰與干擾發(fā)生重疊，僅1 303 cm-1處信號(hào)無干擾，且信號(hào)較強(qiáng)，容易識(shí)別，因此選擇1 303 cm-1作為薏苡仁中黃曲霉毒素G1的定性定量特征峰。另外，隨著黃曲霉毒素G1濃度的增大，黃曲霉毒素G1的其他特征峰如1 475 cm-1和1 617 cm-1逐漸顯現(xiàn)并且響應(yīng)也呈遞增趨勢，而薏苡仁的干擾峰相應(yīng)地減弱。這可能是因?yàn)楫?dāng)黃曲霉毒素G1濃度足夠高時(shí)很容易占據(jù)金納米顆粒所形成的熱點(diǎn)，若更多的黃曲霉毒素G1進(jìn)入熱點(diǎn)，就會(huì)與薏苡仁的成分競爭熱點(diǎn)，從而使薏苡仁的干擾峰相應(yīng)減弱，進(jìn)而凸顯出黃曲霉毒素G1的特征峰。由于1 303 cm-1處的響應(yīng)隨著黃曲霉毒素G1濃度的遞增也呈遞增趨勢，因此以1 303 cm-1處特征峰峰強(qiáng)度(y)對應(yīng)薏苡仁中黃曲霉毒素G1的含量(x，μg/kg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素G1在8～320 μg/kg濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，線性方程為y=239.1x+1 730.7，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.985 5(圖4)，檢出限(LOD，S/N=3)為5.5 μg/kg。傳統(tǒng)的液相色譜法前處理復(fù)雜，處理時(shí)間較長，還耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑，本方法雖在靈敏度略顯不足，但具有快速、簡單等優(yōu)勢。另外，擦拭法提取薏苡仁表面的黃曲霉毒素G1并進(jìn)行D-SERS分析，可達(dá)到靈敏性檢測要求，具有在現(xiàn)場快速檢測中藥材中黃曲霉毒素G1的能力。

圖3 薏苡仁中不同含量的AFG1的D-SERS光譜Fig.3 D-SERS spectrums of different contents of AFG1 in coix seed

圖4 10份樣品中檢測AFG1的重現(xiàn)性Fig.4 Reproducibility of aflatoxin G1 in 10 samples

2.4 薏苡仁中黃曲霉毒素G1檢測的重現(xiàn)性

實(shí)驗(yàn)對真實(shí)樣品進(jìn)行模擬染毒時(shí)，即黃曲霉毒素G1溶液噴灑在藥材表面并揮干，發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素G1會(huì)有少量滲入藥材內(nèi)部，這與中藥材真實(shí)發(fā)霉的情況相符。因此在采取擦拭法提取藥材表面的毒素時(shí)會(huì)存在提取率降低和重現(xiàn)性差的問題。因此實(shí)驗(yàn)同法配制了10份含有40 μg/kg 黃曲霉毒素G1的薏苡仁，在優(yōu)化條件下采用擦拭提取和D-SERS檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 303 cm-1處特征峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為11%，表明圖譜的差異性符合要求，該方法具有良好的重現(xiàn)性，可滿足薏苡仁中黃曲霉毒素G1的現(xiàn)場快速檢測。

3 結(jié) 論

本文采用擦拭法提取，建立了薏苡仁中藥材中黃曲霉毒素G1的D-SERS快速分析方法。在優(yōu)化條件下，AFG1在8～320 μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性，LOD為5.5 μg/kg。方法具有節(jié)約成本、快速、操作簡單等優(yōu)勢，十分適合大批量樣品的現(xiàn)場實(shí)時(shí)快速分析，可為D-SERS技術(shù)在中藥材中黃曲霉毒素G1的檢測及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。